S.N. Elansky, L.Yu. Kokaeva, N.V. Statsyuk, Yu.T. Dyakov
pengenalan
Oomycete Phytophthora infestans (Mont.) De Bary - agen penyebab penyakit busuk daun, penyakit kentang dan tomat yang paling penting secara ekonomi - telah menarik perhatian para peneliti dari berbagai negara selama lebih dari satu setengah abad. Tiba-tiba muncul di Eropa pada pertengahan abad ke-XNUMX, itu menyebabkan epidemi kentang yang tetap diingat oleh banyak generasi.
Sampai sekarang, sering disebut "jamur kelaparan Irlandia". Hampir seratus tahun setelah epidemi pertama, spesies kentang liar Meksiko yang tahan terhadap penyakit busuk daun ditemukan, metode persilangan dengan kentang budidaya dikembangkan (Muller, 1935), dan varietas tahan penyakit busuk daun pertama diperoleh (Pushkarev, 1937) . Namun, tak lama setelah dimulainya budidaya komersial mereka, ras patogen penyakit busuk daun, virulen terhadap varietas tahan, terakumulasi. dan gen resistensi baru yang dimasukkan ke dalam varietas dari kentang liar Meksiko mulai kehilangan efektivitasnya dengan cepat.
Kegagalan dengan penggunaan resistensi monogenik (vertikal) memaksa pemulia untuk mencari cara yang lebih kompleks untuk mengeksploitasi resistensi poligenik (horizontal) nonspesifik. Dalam beberapa tahun terakhir, di beberapa populasi parasit, ras yang sangat agresif mulai menumpuk, menyebabkan erosi bahkan resistensi nonspesifik. Munculnya strain tahan fungisida telah menyebabkan masalah dalam penggunaan bahan kimia pelindung kentang.
Karena perbedaan yang signifikan antara oomycetes dan jamur dalam komposisi kimia, ultrastruktur dan metabolisme, fungisida, terutama yang sistemik, yang digunakan untuk melindungi tanaman dari banyak penyakit jamur, tidak efektif terhadap oomycota.
Oleh karena itu, dalam perlindungan kimia terhadap penyakit busuk daun, beberapa (hingga 12 kali per musim atau lebih) penyemprotan dengan persiapan kontak dari spektrum aksi yang luas digunakan. Sebuah langkah revolusioner adalah penggunaan phenylamides, yang beracun bagi oomycetes dan menyebar secara sistemik pada tanaman. Namun, penggunaannya secara luas dengan cepat menyebabkan akumulasi strain resisten pada populasi jamur (Davidse et al., 1981), yang secara signifikan memperumit perlindungan tanaman. P. infestans secara praktis merupakan satu-satunya parasit di daerah beriklim sedang, bahaya yang dalam pertanian organik tidak dapat dinetralisir tanpa menggunakan alat pelindung kimia (Van Bruggen, 1995).
Hal di atas menjelaskan perhatian besar yang diberikan oleh para peneliti dari berbagai negara untuk mempelajari populasi P. infestans, dinamika kelimpahan dan komposisi genetiknya, serta mekanisme variabilitas genetik.
Siklus hidup R. INFESTANS
Oomycete Phytophthora infestans mengembangkan miselium antar sel dengan haustoria di dalam daun kentang. Memakan jaringan daun, menyebabkan pembentukan bintik-bintik gelap, yang berubah menjadi hitam dan membusuk dalam cuaca basah. Dengan kekalahan yang parah, seluruh daun mati. Setelah periode makan, pertumbuhan terbentuk pada miselium - sporangiofor - yang tumbuh keluar melalui stomata. Dalam cuaca basah, mereka membentuk mekar putih di sekitar bintik-bintik di bagian bawah daun. Di ujung sporangiofor, zoosporangia berbentuk lemon terbentuk, yang pecah dan terbawa oleh semburan hujan (Gbr. 1). Masuk ke tetesan air di permukaan daun kentang, sporangia berkecambah dengan 6-8 zoospora, yang, setelah beberapa saat bergerak, dibulatkan, ditutup dengan cangkang dan berkecambah dengan tabung kecambah. Tunas menembus melalui stomata ke dalam jaringan daun. Dalam kondisi tertentu, sporangium dapat tumbuh melalui tabung pertumbuhan langsung ke jaringan daun. Dalam kondisi yang menguntungkan, waktu dari infeksi hingga pembentukan sporulasi baru hanya 3-4 hari.
Setelah di tanah dan disaring melalui tanah, sporangia mampu menginfeksi umbi-umbian. Umbi yang terkena dampak parah membusuk selama penyimpanan; pada yang terkena dampak lemah, infeksi dapat bertahan sampai musim berikutnya. Selain itu, agen penyebab penyakit busuk daun dapat bertahan di musim dingin dalam bentuk oospora (spora seksual istirahat berdinding tebal) di tanah pada sisa-sisa tanaman dan pada biji tomat. Oospora terbentuk pada organ tanaman hidup ketika strain dari berbagai jenis kawin bertemu dengan kelembaban yang berlebihan. Di musim semi, sporulasi aseksual terbentuk pada umbi yang terinfeksi yang ditanam dan pada residu tanaman dengan oospora, zoospora memasuki tanah dan menyebabkan infeksi pada daun bagian bawah tanaman. Dalam beberapa kasus, miselium dapat tumbuh dari umbi yang terinfeksi di sepanjang bagian hijau tanaman dan biasanya muncul di bagian atas batang.
Perbedaan yang signifikan antara oomycota dan sebagian besar jamur terletak pada dominasi diplofase dalam siklus hidup mereka dengan meiosis gamet dan perkecambahan zigot (oospora) tanpa pembelahan nuklir reduktif. Fitur ini, ditambah heterotallisme dipolar menggantikan biseksualitas, tampaknya memungkinkan untuk diterapkan pada oomycetes pendekatan yang dikembangkan untuk mempelajari populasi eukariota yang lebih tinggi (analisis panmixia dan subdivisi populasi, aliran gen intra dan interpopulasi, dll.). Namun, tiga faktor tidak memungkinkan untuk sepenuhnya mentransfer pendekatan ini ke studi populasi P. infestans.
1. Seiring dengan oospora hibrida, oospora yang subur sendiri dan partenogenetik terbentuk dalam populasi (Fife dan Shaw, 1992; Anikina et al., 1997a; Savenkova, Cherepnikoba-Anirina, 2002; Smirnov, 2003), dan frekuensi pembentukannya mungkin cukup untuk mempengaruhi hasil tes.
2. Proses seksual pada P. infestans memberikan kontribusi yang tidak signifikan terhadap dinamika ukuran populasi, karena jamur berkembang biak terutama dengan spora vegetatif, membentuk lebih dari 90% hasil analisis jenis kawin dengan metode tradisional pada media nutrisi... musim tanam adalah beberapa generasi sporulasi aseksual (perkembangan penyakit polisiklik). Oospora memainkan peran penting dalam pelestarian organisme selama periode ketika tanaman hijau tidak ada (di musim dingin) dan dalam infeksi utama bibit. Kemudian, selama musim panas, reproduksi klon terjadi dan peningkatan atau, sebaliknya, penurunan jumlah klon individu yang timbul sebagai akibat dari rekombinasi seksual, yang terutama ditentukan oleh pemilihan yang lebih beradaptasi. Oleh karena itu, rasio klon individu dalam suatu populasi pada awal dan akhir epifitosis dapat sangat berbeda.
3. Siklus yang dijelaskan adalah khas untuk populasi asli P. infestans di tanah air mereka, Amerika Tengah. Di daerah lain di dunia, proses seksual tidak diketahui selama lebih dari 100 tahun; miselium vegetatif pada umbi kentang yang terinfeksi adalah tahap musim dingin. Siklus hidup benar-benar agamis, dan penyebarannya bersifat fokal: infeksi dari umbi tunggal yang ditanam yang terinfeksi berpindah ke daun, membentuk fokus utama penyakit, yang dapat bergabung dengan perkembangan penyakit yang masif.
Jadi, di beberapa daerah mungkin ada pergantian siklus seksual dan aseksual, sementara di tempat lain - hanya siklus aseksual.
Asal usul P. INFESTANS
P. infestans muncul di Eropa pada akhir paruh pertama abad ke-1991. Karena kentang berasal dari bagian timur laut Amerika Selatan, diasumsikan bahwa parasit dibawa dari sana ke Eropa selama booming sendawa Chili. Namun, penelitian yang dilakukan di stasiun kentang Rockefeller Center di Lembah Toluca, Meksiko memaksa sudut pandang ini untuk dipertimbangkan kembali (Niederhauser, 1993, XNUMX).
1. Di Lembah Toluca, spesies kentang umbi-umbian lokal (Solanum demissum, S. bulbocastanum, dll.) memiliki set gen yang berbeda untuk resistensi vertikal yang dikombinasikan dengan tingkat resistensi nonspesifik yang tinggi, yang menunjukkan ko-evolusi yang lama dengan parasit. Spesies Amerika Selatan, termasuk kentang tanaman, tidak memiliki gen resistensi.
2. Di Lembah Toluca ditemukan isolat dengan tipe kawin A1 dan A2, sehingga populasi kawin silang P. infestans tersebar luas; Sedangkan di tanah air budidaya kentang, di Amerika Selatan parasit ini menyebar secara klonal.
3. Di Lembah Toluca, ada epidemi penyakit busuk daun tahunan yang parah. Oleh karena itu, di kalangan peneliti Amerika Utara (Cornell University), pendapat tentang Mesoamerika (Amerika Tengah) sebagai tempat lahirnya phytophthora kentang sudah mapan (Goodwin et al., 1994).
Peneliti Amerika Selatan tidak sependapat dengan pendapat ini. Mereka percaya bahwa kentang yang dibudidayakan dan parasitnya P. infestans memiliki tanah air yang sama - Andes Amerika Selatan. Mereka mendukung sudut pandang mereka dengan studi molekuler pada analisis polimorfisme DNA genom mitokondria (mtDNA) dan gen nuklir RAS dan -tubulin (Gomez-Alpizar et al., 2007). Mereka menunjukkan bahwa galur yang dikumpulkan dari berbagai belahan dunia diturunkan dari tiga garis leluhur berbeda yang (ketiganya) ditemukan di Andes Amerika Selatan. Haplotipe Andes adalah keturunan dari dua galur: isolat dari garis keturunan mtDNA tertua ditemukan pada Solanaceae yang tumbuh liar dari bagian Anarrhicomenum di Ekuador, sedangkan isolat dari garis kedua umum ditemukan pada kentang, tomat, dan nightshades liar. Di Toluca, bahkan haplotipe langka diturunkan dari hanya satu garis keturunan, dengan variabilitas genetik galur Toluca (frekuensi alelik rendah dari beberapa situs variabel) menunjukkan efek pendiri yang kuat karena penyimpangan baru-baru ini.
Selain itu, spesies baru P. andina ditemukan di Andes, secara morfologis dan genetik mirip dengan P. infestans, yang menurut penulis, menunjuk ke Andes sebagai hot spot spesiasi dalam genus Phytophthora. Terakhir, di Eropa dan Amerika Serikat, populasi P. infestans mencakup kedua garis keturunan Andes, sedangkan di Toluca hanya satu.
Publikasi ini mendorong tanggapan dari sekelompok peneliti dari berbagai negara, yang melakukan banyak pekerjaan eksperimental untuk merevisi penelitian yang dilakukan sebelumnya (Goss et al., 2014). Dalam karya ini, pertama, urutan DNA mikrosatelit yang lebih informatif digunakan untuk mempelajari polimorfisme DNA; kedua, untuk analisis pengelompokan, jalur migrasi, perbedaan waktu populasi, dll. model yang lebih maju digunakan (F-statistik, perkiraan Bayesian, dll.) dan, ketiga, perbandingan digunakan tidak hanya dengan spesies Andes P. andina, di mana sifat hibrida didirikan (P. infestans x Phytophthora sp.) , tetapi juga dengan spesies endemik Meksiko P. mirabilis, P. Ipomoeae, dan Phytophthora phaseoli - secara genetik dekat P. infestans termasuk dalam clade yang sama (Kroon et al., 2012). Sebagai hasil dari analisis ini, dengan jelas ditunjukkan bahwa bagian akar pohon filogenetik dari semua spesies genus Phytophthora yang diambil dalam penelitian, kecuali P. andina hibrida, termasuk strain Meksiko, dan aliran migrasi memiliki arah Meksiko - Andes, dan bukan sebaliknya, dan permulaannya bertepatan dengan penjajahan Eropa di Dunia Baru (300-600 tahun yang lalu). Dengan demikian, munculnya spesies P. infestans, khusus untuk mengalahkan kentang, terjadi di pusat genetik sekunder pembentukan tuberous solanaceae, yaitu. di Amerika Tengah.
Genom P. INFESTANS
Pada tahun 2009, tim ilmuwan internasional mengurutkan genom P infestans lengkap (Haas et al, 2009), yang berukuran 240 MB. Ini beberapa kali lebih banyak daripada spesies yang berkerabat dekat P. sojae (95 Mb), yang menyebabkan busuk akar kedelai, dan P. Ramorum (65 Mb), yang mempengaruhi spesies pohon berharga seperti oak, beech dan beberapa lainnya. Data yang diperoleh menunjukkan bahwa genom berisi sejumlah besar salinan urutan berulang - 74%. Genom mengandung 17797 gen penyandi protein, yang sebagian besar merupakan gen yang terlibat dalam proses seluler, termasuk replikasi DNA, transkripsi, dan translasi protein.
Perbandingan genom dari genus Phytophthora mengungkapkan organisasi genom yang tidak biasa, terdiri dari blok sekuens gen yang dilestarikan, di mana kepadatan gen relatif tinggi, dan isi sekuens berulang relatif rendah, dan masing-masing wilayah dengan non- sekuens gen yang dilestarikan, dengan kepadatan gen yang rendah dan kandungan daerah berulang yang tinggi. Blok konservatif menyumbang 70% (12440) dari semua gen penyandi protein P. infestans. Dalam blok yang dilestarikan, gen biasanya berjarak dekat dengan jarak intergenik rata-rata 604 bp. Di daerah antara blok konservatif, jarak intergenik lebih besar (3700 bp) karena peningkatan kepadatan elemen berulang. Gen sekretorik efektor yang berkembang pesat terletak di daerah miskin gen.
Analisis sekuens genom P. Infestans menunjukkan bahwa kira-kira sepertiga genom termasuk elemen transposabel. Genom P. infestans mengandung keluarga transposon yang jauh lebih berbeda daripada genom lain yang diketahui. Sebagian besar transposon P. Infestans milik keluarga Gipsi.
Sejumlah besar keluarga gen spesifik yang terlibat dalam patogenesis telah diidentifikasi dalam genom P. infestans. Sebagian besar dari mereka mengkodekan protein efektor yang mengubah fisiologi tanaman inang dan berkontribusi terhadap infeksinya. Mereka terbagi dalam dua kategori besar: efektor apoplastik, yang bekerja di ruang antar sel (apoplas), dan efektor sitoplasma, yang memasuki sel melalui haustoria. Efektor apoplastik termasuk enzim hidrolitik yang disekresikan seperti protease, lipase dan glikosilase yang menghancurkan sel tumbuhan; inhibitor enzim pertahanan tanaman inang, dan racun nekrotikan seperti protein seperti Nep1 (NPL) dan protein kaya sistein kecil seperti Pcf (SCR).
Gen efektor P. infestans banyak dan biasanya lebih besar dari gen non-patogen. Yang paling terkenal adalah efektor sitoplasma RXLR dan Crinkle (CNR). Efektor sitoplasma khas oomycetes adalah protein RXLR. Semua gen efektor RXLR yang ditemukan sejauh ini mengandung gugus terminal amino Arg-XLeu-Arg, di mana X adalah asam amino. Hasil penelitian menunjukkan bahwa terdapat 563 gen RXLR pada genom P. infestans, yaitu 60% lebih banyak dibandingkan pada P. sojae dan P. ramorum. Sekitar setengah dari gen RXLR dalam genom P. infestans adalah spesies yang spesifik. Efektor RXLR memiliki berbagai macam urutan. Di antara mereka, satu keluarga besar dan 150 keluarga kecil diidentifikasi. Berbeda dengan proteom utama, gen efektor RXLR biasanya terletak di daerah genom yang miskin gen dan kaya pengulangan. Unsur-unsur bergerak yang menentukan dinamisme daerah-daerah ini mendorong rekombinasi dalam gen-gen ini.
Efektor CRN sitoplasma awalnya diidentifikasi dalam transkrip P. infestans yang mengkode peptida yang menginduksi nekrosis jaringan tanaman. Sejak penemuan mereka, sedikit yang diketahui tentang keluarga efektor ini. Analisis genom P. Infestans mengungkapkan keluarga besar dari 196 gen CRN, yang secara signifikan lebih besar daripada P. sojae (100 CRN) dan P. ramorum (19 CRN). Seperti RXLR, CRN adalah protein modular dan terdiri dari domain LFLAK terminal-N yang sangat terkonservasi (50 asam amino) dan domain DWL yang berdekatan yang mengandung gen berbeda. Kebanyakan CRN (60%) memiliki peptida sinyal.
Kemungkinan berbagai CRN untuk mengganggu proses seluler tanaman inang telah dipelajari. Dalam analisis nekrosis tanaman, penghilangan protein CRN2 memungkinkan untuk mengidentifikasi wilayah terminal-C yang terdiri dari 234 asam amino (posisi 173-407, domain DXG) dan menyebabkan kematian sel. Analisis gen CRN P. infestans mengungkapkan empat daerah terminal-C yang berbeda, yang juga menyebabkan kematian sel di dalam tanaman. Ini termasuk domain DC yang baru diidentifikasi (P. Infestans memiliki 18 gen dan 49 pseudogen), serta domain D2 (14 dan 43) dan DBF (2 dan 1) yang mirip dengan protein kinase. Protein domain CRN yang diekspresikan dalam tanaman dilestarikan (dengan tidak adanya peptida sinyal) dalam sel tanaman dan merangsang kematian sel melalui mekanisme intraseluler. 255 sekuens lain yang mengandung domain CRN kemungkinan besar tidak berfungsi sebagai gen.
Peningkatan jumlah dan ukuran keluarga gen efektor RXLR dan CRN diduga karena rekombinasi homolog non-alel dan duplikasi gen. Terlepas dari kenyataan bahwa genom mengandung sejumlah besar elemen bergerak aktif, masih belum ada bukti langsung transfer gen efektor.
Metode yang digunakan dalam studi struktur populasi
Studi tentang struktur genetik populasi saat ini didasarkan pada analisis kultur murni dari galur penyusunnya. Analisis populasi tanpa mengisolasi tanaman murni juga dilakukan untuk tujuan tertentu, seperti misalnya mempelajari agresivitas suatu populasi atau adanya strain yang resisten terhadap fungisida di dalamnya (Filippov et al., 2004; Derevyagina et al., 1999). Jenis penelitian ini melibatkan penggunaan metode khusus, yang deskripsinya berada di luar cakupan tinjauan ini. Untuk analisis komparatif galur, sejumlah metode digunakan, berdasarkan analisis struktur DNA dan studi manifestasi fenotipik. Analisis komparatif populasi harus berurusan dengan sejumlah besar isolat, yang memaksakan persyaratan tertentu pada metode yang digunakan. Idealnya, mereka harus memenuhi persyaratan berikut (Cooke, Lees, 2004, Mueller, Wolfenbarger, 1999):
- murah, mudah diterapkan, tidak memerlukan pengeluaran waktu yang signifikan, didasarkan pada teknologi yang tersedia secara umum (misalnya, PCR);
- harus menghasilkan sejumlah besar fitur penanda kodominan independen yang cukup besar;
- memiliki reproduktifitas tinggi;
- gunakan jumlah minimum jaringan yang akan diperiksa;
- spesifik untuk substrat (kontaminasi yang ada dalam kultur tidak boleh mempengaruhi hasil);
- tidak memerlukan penggunaan prosedur berbahaya dan bahan kimia yang sangat beracun.
Sayangnya, tidak ada metode yang sesuai dengan semua parameter di atas. Untuk studi perbandingan galur di zaman kita, metode yang digunakan berdasarkan analisis sifat fenotipik: virulensi terhadap varietas kentang dan tomat (ras kentang dan tomat), tipe kawin, spektrum peptidase dan isoenzim isomerase glukosa-6-fosfat, dan pada analisis struktur DNA: panjang polimorfisme restriksi fragmen (RFLP), yang biasanya dilengkapi dengan probe hibridisasi RG 57, analisis pengulangan mikrosatelit (SSR dan InterSSR), amplifikasi dengan primer acak (RAPD), amplifikasi fragmen restriksi (AFLP), amplifikasi dengan primer yang homolog dengan sekuens elemen bergerak (misalnya, Inter SINE PCR), penentuan haplotipe DNA mitokondria.
Deskripsi singkat tentang metode untuk studi perbandingan galur yang digunakan dalam pekerjaan dengan P. Infestans
Ciri-ciri penanda fenotipik
Balapan "Kentang"
Ras "Kentang" adalah penanda yang umum diteliti dan digunakan. Ras "kentang sederhana" memiliki satu gen untuk virulensi kentang, "kompleks" - setidaknya dua. Black et al (1953), merangkum semua data yang tersedia untuk mereka, menemukan bahwa ras phytophthora mampu menginfeksi tanaman dengan gen / gen resistensi yang sesuai dengan gen / gen virulensi P. infestans, dan ditemukan ras 1, 2, 3 , dan 4 yang menginfeksi tanaman masing-masing dengan gen R1, R2, R3 dan R4, yaitu interaksi antara parasit dan inang terjadi berdasarkan gen-demi-gen. Selanjutnya, Black, dengan partisipasi Gallegly dan Malcolmson, menemukan gen resistensi R5, R6, R7, R8, R9, R10 dan R11 serta ras yang sesuai (Black, 1954; Black & Gallegly, 1957; Malcolmson & Black, 1966; Malcolmson, 1970).
Ada banyak data tentang komposisi ras patogen dari berbagai daerah. Tanpa menganalisis data ini secara rinci, kami hanya akan menunjukkan tren umum: di mana varietas dengan gen resistensi baru atau kombinasinya digunakan, pada awalnya ada beberapa kelemahan penyakit busuk daun, tetapi kemudian ras dengan gen virulensi yang sesuai muncul dan dipilih dan berjangkit. penyakit busuk daun kembali terjadi. Virulensi spesifik terhadap 4 gen resistensi pertama (R1-R4) jarang diamati pada koleksi yang dikumpulkan sebelum introduksi ke dalam budidaya varietas dengan gen ini, tetapi jumlah strain virulen meningkat tajam ketika patogen diparasit pada varietas yang membawa gen ini. Gen 5-11, di sisi lain, cukup umum dalam koleksi (Shaw, 1991).
Sebuah studi tentang rasio berbagai ras selama musim tanam, yang dilakukan pada akhir 1980-an, menunjukkan bahwa pada awal perkembangan penyakit, klon dengan agresivitas rendah dan 1-2 gen virulensi mendominasi populasi.
Selanjutnya, seiring berkembangnya penyakit busuk daun, konsentrasi klon asli menurun dan jumlah ras "kompleks" dengan agresivitas tinggi meningkat. Terjadinya yang terakhir mencapai 100% pada akhir musim. Saat menyimpan umbi, terjadi penurunan agresivitas dan hilangnya gen virulensi individu. Dinamika penggantian klon dapat terjadi pada varietas yang berbeda dengan cara yang berbeda (Rybakova & Dyakov, 1990). Namun, penelitian kami pada tahun 2000-2010 menunjukkan bahwa ras kompleks ditemukan sejak awal epifitosis di antara strain yang diisolasi dari kentang dan tomat. Hal ini kemungkinan disebabkan oleh perubahan populasi P. Infestans di Rusia.
Pada 1988-1995, kejadian “superras” dengan semua atau hampir semua gen virulensi di berbagai daerah mencapai 70-100%. Situasi ini dicatat, misalnya, di Belarus, di wilayah Leningrad dan Moskow, di Ossetia Utara dan di Jerman (Ivanyuk et al., 2002a, 2002b; Polityko, 1994; Schober-Butin et al., 1995).
Lomba "Tomat"
Dalam kultivar tomat, hanya ditemukan 2 gen ketahanan terhadap penyakit busuk daun - Ph1 (Gallegly & Marvell, 1955) dan Ph2 (Al-Kherb, 1988). Seperti dalam kasus ras kentang, interaksi antara tomat dan P. infestans terjadi berdasarkan gen-demi-gen. Ras T0 menginfeksi varietas yang tidak memiliki gen ketahanan (sebagian besar varietas yang digunakan industri), ras T1 menginfeksi varietas dengan gen Ph1 (Ottawa), dan ras T2 menginfeksi varietas dengan gen Ph2.
Di Rusia, hampir secara eksklusif T0 ditemukan pada kentang; pada tomat di awal musim, T0 menang, tetapi kemudian digantikan oleh ras T1 (Dyakov et al., 1975, 1994). Setelah tahun 2000, T1 pada kentang di banyak populasi mulai terjadi pada awal epifitosis. Di Amerika Serikat, strain kentang tidak patogen terhadap tomat, serta ras T0, T1, dan T2, sedangkan T1 dan T2 mendominasi tomat (Vartanian & Endo, 1985; Goodwin et al., 1995).
Jenis kawin
Untuk penelitian ini, strain penguji (referensi) dengan tipe kawin yang diketahui - A1 dan A2 diperlukan. Isolat uji diinokulasikan secara berpasangan dalam cawan Petri dengan media oat agar. Setelah inkubasi selama 10 hari, pelat diperiksa untuk ada tidaknya oospora dalam media di zona kontak strain. Ada 4 pilihan: galur termasuk tipe kawin A1, jika membentuk oospora dengan penguji A2, menjadi A2, jika membentuk oospora dengan penguji A1, menjadi A1A2, jika membentuk oospora dengan kedua penguji, atau steril ( 00), jika tidak membentuk oospora tanpa penguji (dua kelompok terakhir jarang terjadi).
Untuk lebih cepat menentukan jenis perkawinan, dilakukan upaya untuk mengidentifikasi daerah genom yang terkait dengan jenis perkawinan, dengan tujuan penggunaan lebih lanjut untuk menentukan jenis perkawinan dengan PCR. Salah satu percobaan pertama yang berhasil untuk mengidentifikasi situs tersebut dilakukan oleh peneliti Amerika (Judelson et al., 1995). Dengan menggunakan metode RAPD, mereka mampu mengidentifikasi wilayah W16 yang terkait dengan tipe kawin pada keturunan dari dua isolat yang disilangkan, dan merancang sepasang primer 24-bp untuk amplifikasinya (W16-1 (5'-AACACGCACAAGGCATAATAAATGTA-3 ' ) dan W16-2 (5' -GCGTAATGTAGCGTAACAGCTTC-3 ') Setelah restriksi produk PCR dengan enzim restriksi HaeIII, isolat dengan tipe pasangan A1 dan A2 dapat dipisahkan.
Upaya lain untuk mendapatkan penanda PCR untuk menentukan jenis perkawinan dilakukan oleh peneliti Korea (Kim, Lee, 2002). Mereka mengidentifikasi produk tertentu menggunakan metode AFLP. Akibatnya, sepasang primer PHYB-1 (maju) (5'-GATCGGATTAGTCAGACGAG-3 ') dan PHYB-2 (5'-GCGTCTGCAAGGCGCATTTT-3') dikembangkan, memungkinkan amplifikasi selektif wilayah genom yang terkait dengan perkawinan A2 Tipe. Selanjutnya, mereka melanjutkan pekerjaan ini dan merancang primer 5 'AAGCTATACTGGGACAGGGT-3' (INF-1, maju) dan 5'-GCGTTCTTTCGTATTACCAC-3 '(INF-2), memungkinkan amplifikasi selektif dari karakteristik wilayah Mat-A1 dari strain dengan perkawinan tipe A1. Penggunaan diagnostik PCR jenis kawin menunjukkan hasil yang baik ketika mempelajari populasi P. infestans di Republik Ceko (Mazakova et al., 2006), Tunisia (Jmour, Hamada, 2006), dan wilayah lainnya. Di laboratorium kami (Mytsa, Elansky, tidak dipublikasikan), 34 galur P. infestans diisolasi dari organ kentang dan tomat yang terkena di berbagai wilayah Rusia (wilayah Kostroma, Ryazan, Astrakhan, dan Moskow) dianalisis. Hasil analisis PCR menggunakan primer spesifik lebih dari 90% bertepatan dengan hasil analisis jenis kawin dengan metode tradisional pada media nutrisi.
Tabel 1. Variabilitas resistensi dalam klon Sib 1 (Elansky et al., 2001)
Lokasi pengambilan sampel | Jumlah isolat yang dianalisis | Jumlah strain sensitif (S), resisten lemah (SR) dan resisten (R), pcs (%) | ||
S | SR | R | ||
G. Vladivostok | 10 | 1 (10) | 4 (40) | 5 (50) |
G. Chita | 5 | 0 | 0 | 5 (100) |
Irkutsk | 9 | 9 (100) | 0 | 0 |
G. Krasnoyarsk | 13 | 12 (92) | 1 (8) | 0 |
Kota Yekaterinburg | 15 | 8 (53) | 1 (7) | 6 (40) |
O. Sakhalin | 66 | 0 | 0 | 66 (100) |
Wilayah Omsk | 18 | 0 | 0 | 18 (100) |
Resistensi metalaksil sebagai penanda populasi
Pada awal 1980-an, wabah penyakit busuk daun yang kuat yang disebabkan oleh strain P. infestans yang resisten metalaksil tercatat di berbagai daerah. Pertanian kentang di banyak negara telah mengalami kerugian yang signifikan (Dowley & O'Sullivan, 1981; Davidse et al., 1983; Derevyagina, 1991). Sejak itu, di banyak negara di dunia, pemantauan terus-menerus terhadap terjadinya galur yang resisten terhadap fenilamid pada populasi P. infestans telah dilakukan. Selain penilaian praktis tentang prospek penggunaan obat yang mengandung fenilamid, membangun sistem tindakan perlindungan dan memprediksi epifit, resistensi terhadap obat ini telah menjadi salah satu fitur penanda yang banyak digunakan untuk analisis komparatif populasi patogen ini. Namun, penggunaan resistensi terhadap metalaksil dalam studi populasi komparatif harus dilakukan dengan mempertimbangkan fakta bahwa: 1 - dasar genetik resistensi belum ditentukan secara tepat, 2 - resistensi terhadap metalaksil adalah sifat tergantung selektif yang dapat berubah tergantung pada penggunaan fenilamid, 3 - berbeda tingkat kepekaan terhadap strain metalaksil dalam satu garis klon (Tabel 1).
Spektrum isozim
Penanda isozim biasanya tidak tergantung pada kondisi eksternal, menunjukkan pewarisan Mendel dan bersifat kodominan, memungkinkan untuk membedakan antara homo dan heterozigot. Penggunaan protein sebagai penanda gen memungkinkan untuk mengidentifikasi reorganisasi besar materi genetik, termasuk mutasi kromosom dan genom, dan substitusi asam amino tunggal.
Studi elektroforesis protein telah menunjukkan bahwa sebagian besar enzim ada dalam organisme dalam bentuk beberapa fraksi yang berbeda dalam mobilitas elektroforesis. Fraksi ini adalah hasil pengkodean berbagai bentuk enzim oleh lokus yang berbeda (isozim atau isozim) atau oleh alel yang berbeda dari lokus yang sama (allozim atau alloenzim). Artinya, isozim adalah bentuk yang berbeda dari satu enzim. Bentuk yang berbeda memiliki aktivitas katalitik yang sama, tetapi sedikit berbeda dalam substitusi asam amino tunggal dalam peptida dan muatannya. Perbedaan tersebut terungkap selama elektroforesis.
Dalam studi strain P. infestans, spektrum isoenzim dari dua protein, peptidase dan isomerase glukosa-6-fosfat, digunakan (enzim ini monomorfik pada populasi Rusia; oleh karena itu, metode studinya tidak disajikan dalam karya ini) . Untuk memisahkannya menjadi isozim dalam medan listrik, preparat protein yang diisolasi dari organisme yang dipelajari diterapkan pada pelat gel yang ditempatkan dalam medan listrik. Tingkat difusi protein individu dalam gel tergantung pada muatan dan berat molekul; oleh karena itu, dalam medan listrik, campuran protein dipisahkan menjadi fraksi individu, yang dapat divisualisasikan menggunakan pewarna khusus.
Studi isoenzim peptidase dilakukan pada selulosa asetat, pati atau gel poliakrilamida. Yang paling nyaman adalah metode yang didasarkan pada penggunaan gel selulosa asetat yang diproduksi oleh Helena Laboratories Inc. Ini tidak memerlukan bahan uji dalam jumlah besar, memungkinkan seseorang untuk mendapatkan pita kontras pada gel setelah elektroforesis untuk kedua lokus enzim, implementasinya tidak memerlukan waktu dan biaya bahan yang besar (Gbr. 2).
Sepotong kecil miselium dipindahkan ke dalam tabung mikro 1,5 ml, ditambahkan 1-2 tetes air suling ke dalamnya. Setelah itu, sampel dihomogenkan (misalnya dengan bor listrik dengan lampiran plastik yang sesuai untuk tabung mikro) dan diendapkan selama 25 detik pada sentrifus pada 13000 rpm. Dari setiap tabung mikro, 8 l. supernatan dipindahkan ke pelat aplikator.
Gel selulosa asetat dikeluarkan dari wadah penyangga, diapit di antara dua lembar kertas saring dan ditempatkan dengan lapisan kerja di atas dasar plastik aplikator. Solusi dari piring ditransfer oleh aplikator ke gel 2-4 kali. Gel dipindahkan ke ruang elektroforesis,
Tabel 2. Komposisi larutan yang digunakan untuk pewarnaan gel selulosa asetat dalam analisis isoenzim peptidase, setetes cat (bromofenol biru) diletakkan di tepi gel.
TRIS HCl, 0,05M, Ph 8,0 2 ml
Peroksidase, 1000 U / ml 5 tetes
o-dianisidin, 4 mg / ml 8 tetes
MgCl2, 20 mg / ml 2 tetes
Gly-Leu, 15 mg / ml 10 tetes
L-asam amino oksidase, 20 u / ml 2 tetes
Elektroforesis dilakukan selama 20 menit. pada 200 V. Setelah elektroforesis, gel dipindahkan ke meja pengecatan dan diwarnai dengan larutan pengecatan khusus (Tabel 2). 10 ml agar-agar DIFCO 1,6% sebelumnya dilelehkan dalam oven microwave, didinginkan hingga 60 ° C, setelah itu 2 ml agar-agar dicampur dengan campuran cat dan dituangkan ke dalam gel. Garis-garis muncul dalam waktu 15-20 menit. Reagen L-asam amino oksidase ditambahkan sesaat sebelum mencampur larutan dengan agar-agar cair.
Dalam populasi Rusia, lokus Pep 1 diwakili oleh genotipe 100/100 dan 92/100. Homozigot 92/92 sangat jarang (sekitar 0,1%). Locus Rehr 2 diwakili oleh tiga genotipe 100/100, 100/112, dan 112/112, dan ketiga varian tersebut cukup umum (Elanky dan Smirnov, 3, Gambar 2003).
Penelitian genom
Pembatasan panjang fragmen polimorfisme dengan hibridisasi berikutnya (RFLP-RG 57)
Total DNA diperlakukan dengan enzim restriksi Eco R1, fragmen DNA dipisahkan dengan elektroforesis gel agarosa. DNA inti sangat besar dan memiliki banyak urutan berulang; oleh karena itu, analisis langsung dari banyak fragmen yang diperoleh dengan aksi enzim restriksi sulit dilakukan. Oleh karena itu, fragmen DNA yang dipisahkan dalam gel dipindahkan ke membran khusus dan digunakan untuk hibridisasi dengan probe RG 57, yang mencakup nukleotida yang diberi label dengan label radioaktif atau fluoresen. Probe ini berhibridisasi dengan urutan genom berulang (Goodwin et al., 1992, Forbes et al., 1998). Setelah visualisasi hasil hibridisasi pada bahan ringan atau radioaktif, diperoleh profil multilokus hibridisasi (sidik jari), yang diwakili oleh 25-29 fragmen (Forbes et al., 1998). Keturunan aseksual (klonal) akan memiliki profil yang sama. Dengan pengaturan garis-garis pada elektroforetogram, persamaan dan perbedaan organisme yang dibandingkan dinilai.
Haplotipe DNA mitokondria
Pada sebagian besar sel eukariotik, mtDNA disajikan dalam bentuk molekul DNA melingkar beruntai ganda, yang, tidak seperti kromosom inti sel eukariotik, bereplikasi secara semi-konservatif dan tidak terkait dengan molekul protein.
Genom mitokondria P. infestans diurutkan, sejumlah karya dikhususkan untuk analisis panjang fragmen restriksi (Carter et al, 1990, Goodwin, 1991, Gavino, Fry, 2002). Setelah Griffith dan Shaw (1998) mengembangkan metode sederhana dan cepat untuk menentukan haplotipe mtDNA, penanda ini menjadi salah satu yang paling populer dalam studi P. Infestans.F2-R2 (Tabel 4) dan restriksi selanjutnya dengan enzim restriksi MspI (fragmen pertama ) dan EcoR4 (fragmen kedua). Metode ini memungkinkan untuk mengidentifikasi 3 haplotipe: Ia, IIa, Ib, IIb. Tipe II berbeda dari tipe I dengan adanya insert 1 bp dan lokasi yang berbeda dari situs restriksi di daerah P1 dan P2 (Gbr. 4).
Sejak 1996, di antara galur yang dikumpulkan di wilayah Rusia, hanya haplotipe Ia dan IIa yang dicatat (Elansky et al., 2001, 2015). Mereka dapat diidentifikasi setelah pemisahan produk restriksi dengan primer F2-R2 dalam medan listrik (Gbr. 4, 5). Jenis mtDNA digunakan dalam analisis komparatif galur dan populasi. Dalam sejumlah karya, jenis DNA mitokondria digunakan untuk mengisolasi galur klonal dan membuat paspor isolat P. infestans (Botez et al., 2007; Shein et al., 2009). Dengan menggunakan metode PCR-RFLP, disimpulkan bahwa mtDNA bersifat heterogen pada strain P. infestans yang sama (Elansky dan Milyutina, 2007). Kondisi amplifikasi: 1x (500 detik 94 ° C), 40x (30 detik 90 ° C, 30 detik 52 ° C, 90 detik 72 ° C); 1x (5 menit 72 ° C). Campuran reaksi: (20 l): 0,2 U Taq DNA polimerase, 1x 2,5 mM buffer MgCl2-Taq, 0,2 mM setiap dNTP, 30 pM primer dan 5 ng DNA yang dianalisis, air deionisasi - hingga 20 l.
Pembatasan produk PCR dilakukan selama 4-6 jam pada suhu 37°C. Campuran restriksi (20 l): 10x MspI (2 l), 10x buffer restriksi (2 l), air deionisasi (6 l), produk PCR (10 l).
Tabel 3. Primer yang digunakan untuk amplifikasi daerah polimorfik mtDNA
Tempat | Primer | Panjang dan penempatan primer | Panjang produk PCR | Batasi |
---|---|---|---|---|
P2 | F2: 5'- TTCCCTTTGTCCTCTACCGAT | 21; 13619-13639 | 1070 | MspI |
R2: 5'- TTACGGCGGTTTAGCACATACA | 22; 14688-14667 | |||
P4 | F4: 5'- TGGTCATCCAGAGTTTATGTT | 22; 9329-9350 | 964 | Eco RI |
R4:5 - CCGATACCGATACCAGCACCAA | 22; 10292-10271 |
Amplifikasi primer acak (RAPD)
Saat melakukan RAPD, satu primer digunakan (kadang-kadang beberapa primer secara bersamaan) dengan urutan nukleotida sewenang-wenang, biasanya panjangnya 10 nukleotida, dengan kandungan tinggi (dari 50%) nukleotida GC dan suhu anil rendah (sekitar 35 ° C) . Primer semacam itu "mendarat" di banyak situs pelengkap dalam genom. Setelah amplifikasi, sejumlah besar amplikon diperoleh. Jumlahnya tergantung pada primer (s) yang digunakan dan kondisi reaksi (konsentrasi MgCl2 dan suhu anil).
Visualisasi amplikon dilakukan dengan destilasi dalam poliakrilamida atau gel agarosa. Saat melakukan analisis RAPD, perlu untuk memantau kemurnian bahan yang dianalisis dengan cermat, karena: kontaminasi dengan benda hidup lainnya dapat menyebabkan peningkatan yang signifikan dalam jumlah artefak, yang cukup banyak bahkan dalam analisis bahan murni (Perez et al, 1998). Penggunaan metode ini dalam studi genom P. infestans tercermin dalam banyak karya (Judelson, Roberts, 1999, Ghimire et al., 2002, Carlisle et al., 2001). Pemilihan kondisi reaksi dan primer (51 primer 10-nukleotida dipelajari) diberikan dalam artikel oleh Abu-El Samen et al., (2003).
Analisis Ulang Mikrosatelit (SSR)
Pengulangan mikrosatelit (pengulangan urutan sederhana, SSR) adalah pengulangan urutan pendek 1-3 (kadang-kadang hingga 6) nukleotida yang ada dalam genom nuklir semua eukariota. Jumlah pengulangan berturut-turut dapat bervariasi dari 10 sampai 100. Lokus mikrosatelit terjadi dengan frekuensi yang cukup tinggi dan kurang lebih merata di seluruh genom (Lagercrantz et al., 1993). Polimorfisme sekuens mikrosatelit dikaitkan dengan perbedaan jumlah pengulangan motif dasar. Marka mikrosatelit bersifat kodominan, sehingga dapat digunakan untuk menganalisis struktur populasi, menentukan kekerabatan, jalur migrasi genotipe, dll. Keuntungan lain dari penanda ini termasuk polimorfismenya yang tinggi, reproduktifitas yang baik, netralitas, dan kemampuan untuk melakukan analisis dan evaluasi otomatis. Analisis polimorfisme pengulangan mikrosatelit dilakukan dengan amplifikasi PCR menggunakan primer yang melengkapi sekuens unik yang mengapit lokus mikrosatelit. Awalnya, analisis dilakukan dengan pemisahan produk reaksi pada gel poliakrilamida. Kemudian, karyawan perusahaan Applied Biosystems mengusulkan untuk menggunakan primer berlabel fluoresen dengan deteksi produk reaksi menggunakan detektor laser otomatis (Diehl et al., 1990), dan kemudian pengurutan DNA otomatis standar (Ziegle et al., 1992). Pelabelan primer dengan berbagai pewarna fluoresen memungkinkan untuk menganalisis beberapa penanda sekaligus dalam satu jalur dan, karenanya, secara signifikan meningkatkan produktivitas metode dan meningkatkan akurasi analisis.
Publikasi pertama yang ditujukan untuk penggunaan analisis RSK untuk studi P. infestans muncul pada awal 2000-an. (Knapova, Gisi, 2002). Tidak semua penanda yang diusulkan oleh penulis menunjukkan tingkat polimorfisme yang cukup, namun dua di antaranya (4B dan G11) dimasukkan dalam kumpulan 12 penanda SSR yang diusulkan oleh Lees et al (2006) dan kemudian diadopsi dalam jaringan penelitian Eucablight (www.eucablight .org) sebagai standar untuk P. infestans. Beberapa tahun kemudian, sebuah penelitian diterbitkan tentang pembuatan sistem analisis multipleks DNA P. infestans berdasarkan delapan penanda SSR (Li et al., 2010). Akhirnya, setelah mengevaluasi semua penanda yang diusulkan sebelumnya dan memilih yang paling informatif, serta mengoptimalkan primer, label fluoresen, dan kondisi amplifikasi, tim penulis yang sama mempresentasikan sistem analisis multipleks satu langkah yang mencakup 12 penanda (Tabel 4; Li dkk., 2013a). Primer yang digunakan dalam sistem ini dipilih dan diberi label dengan salah satu dari empat penanda fluoresen (FAM, VIC, NED, PET) sehingga rentang ukuran alel primer dengan label yang sama tidak tumpang tindih.
Penulis melakukan analisis pada penguat PTC200 (MJ Research, USA) menggunakan kit PCR multipleks QIAGEN atau kit PCR Mikrosatelit QIAGEN Typeit. Volume campuran reaksi adalah 12.5 L. Kondisi amplifikasi adalah sebagai berikut: untuk PCR multipleks QIAGEN: 95 ° C (15 menit), 30x (95 ° C (20 detik), 58 ° C (90 detik), 72 ° C (60 detik), 72 ° C (20 detik), min)); untuk QIAGEN Type-it Microsatelite PCR: 95 ° C (5 menit), 28x (95 ° C (30 detik), 58 ° C (90 detik), 72 ° C (20 detik), 60 ° C ( 30 menit).
Pemisahan dan visualisasi produk PCR dilakukan menggunakan penganalisis DNA kapiler otomatis ABI3730 (Biosistem Terapan).
Tabel 4. Karakteristik 12 marka SSR standar yang digunakan untuk genotipe P. Infestans (Li et al., 2013a)
Nama | Jumlah alel | Kisaran ukuran alel (bp) | аймеры |
Babi11 | 13 | 130-180 | F: NED-TGCTATTTATCAAGCGTGGG R: GTTTTCAATCTGCAGCCGTAAGA |
Ft02 | 4 | 255-275 | F: NED-ACTTGCAGAACTACCGCC R: GTTTGACCACTTTCCTCGGTTC |
PinfSSR11 | 4 | 325-360 | F: NED-TTAAGCCACGACATGAGCTG R: GTTAGACAATTGTTTTGTGGTCGC |
D13 | 16 | 100-185 | FAM-TGCCCCCTGCTCACTC R: GCTCGAATTCATTTTCAGACTTG |
PinfSSR8 | 4 | 250-275 | F: FAM-AATCTGATCGCAACTGAGGG R: GTTTACAAGATACACACACGTCGCTCC |
PinfSSR4 | 7 | 280-305 | F: FAM-TCTTGTTCGAGTATGCGACG R: GTTTCACTTCGGGAGAAAAGGCTTC |
Ft04 | 4 | 160-175 | F: VIC-AGCGGCTTTACCGATGG R: GTTTCAGCGGCTGTTTCGAC |
Ft70 | 3 | 185-205 | F: VIC-ATGAAAATACGTCAATGTCCG R: CGTTGGATATTTCTATTTCTTCG |
PinfSSR6 | 3 | 230-250 | F: GTTTTGGTGGGGCTGAAGTTTT R: VIC-TCGCCACAAGATTTATTCCG |
Ft63 | 3 | 265-280 | F: VIC-ATGACGAAGATGAAAGTGAGG R: CGTATTTTCCTGTTTATCTAACACC |
PinfSSR2 | 3 | 165-180 | F: PET-CGACTTTCTACATCAACCGGC R: GTTTGCTTGGACTGCGTCTTTAGC |
Pi4B | 5 | 200-295 | F: PET-AAAATAAAGCCTTTGGTTCA R: GCAAGCGGGTTTGTAGATT |
Contoh visualisasi hasil analisis ditunjukkan pada Gambar. 6. Hasil dianalisis menggunakan perangkat lunak GeneMapper 3.7 dengan membandingkan data yang diperoleh dengan isolat yang diketahui. Untuk memudahkan interpretasi hasil analisis, perlu memasukkan 1-2 isolat referensi dengan genotipe yang diketahui dalam setiap penelitian.
Metode penelitian yang diusulkan diuji pada sejumlah besar sampel lapangan, setelah itu penulis menstandardisasi protokol antara laboratorium dari dua organisasi, The James Hutton Institute (UK) dan Wageningen University & Research (Belanda), yang, bersama dengan kemungkinan menggunakan kartu FTA standar untuk pengumpulan dan pengiriman sampel DNA P. infestans yang disederhanakan memungkinkan untuk membicarakan kemungkinan penggunaan komersial dari pengembangan ini. Selain itu, metode genotipe isolat P. infestans yang cepat dan akurat menggunakan analisis SSR multipleks memungkinkan dilakukannya studi standar populasi patogen ini dalam skala global, dan pembuatan database dunia tentang penyakit busuk daun dalam kerangka kerja Proyek Eucablight (www.eucablight.org), termasuk , termasuk hasil analisis mikrosatelit, memungkinkan untuk melacak kemunculan dan penyebaran genotipe baru di seluruh dunia.
Polimorfisme panjang fragmen restriksi yang diperkuat (AFLP). AFLP (amplified fragmen panjang polimorfisme) adalah teknologi untuk menghasilkan penanda molekuler acak menggunakan primer tertentu. Dalam AFLP, DNA diperlakukan dengan kombinasi dua enzim restriksi. Adaptor khusus diikat ke ujung lengket dari fragmen restriksi.
Fragmen-fragmen ini kemudian diperkuat menggunakan primer yang melengkapi urutan adaptor dan situs restriksi dan sebagai tambahan membawa satu atau lebih basa acak pada ujungnya. Kumpulan fragmen yang diperoleh bergantung pada enzim restriksi dan nukleotida yang dipilih secara acak pada ujung 3' primer (Vos et al., 3). AFLP - genotipe digunakan untuk mempelajari variasi genetik berbagai organisme dengan cepat.
Penjelasan rinci tentang metode ini diberikan dalam karya Mueller, Wolfenbarger, 1999, Savelkoul et al., 1999. Banyak pekerjaan yang membandingkan resolusi metode AFLP dan SSR telah dilakukan oleh para peneliti Cina. Karakteristik fenotip dan genotip dari 48 isolat P. infestans yang dikumpulkan dari lima wilayah Cina Utara dipelajari. Spektrum AFLP mengungkapkan delapan genotipe DNA yang berbeda, berbeda dengan genotipe SSR, yang tidak ditemukan keragamannya (Guo et al., 2008).
Amplifikasi dengan primer yang homolog dengan urutan elemen bergerak
Penanda yang berasal dari urutan retrotransposon sangat cocok untuk pemetaan genetik, studi keragaman genetik dan proses evolusi (Schulman, 2006). Jika primer dibuat yang melengkapi urutan stabil elemen seluler tertentu, dimungkinkan untuk memperkuat wilayah genom yang terletak di antara mereka. Dalam studi agen penyebab penyakit busuk daun, metode penguatan bagian genom menggunakan primer yang melengkapi urutan inti retropazone SINE (Short Interspersed Nuclear Elements) berhasil diterapkan (Lavrova dan Elansky, 2003). Metode ini mengungkapkan perbedaan bahkan pada keturunan aseksual dari satu isolat. Dalam hal ini, disimpulkan bahwa metode antar - SINE - PCR sangat spesifik dan laju pergerakan elemen SINE dalam genom Phytophthora tinggi.
Dalam genom P. infestans, 12 famili retrotransposon pendek (SINEs) telah diidentifikasi; distribusi spesies retrotransposon pendek diselidiki, elemen (SINEs) diidentifikasi yang ditemukan dalam genom hanya P. infestans (Lavrova, 2004).
Fitur penerapan metode studi banding strain dalam studi populasi
Ketika merencanakan sebuah penelitian, perlu dipahami dengan jelas tujuan yang ingin dicapai dan menggunakan metode yang tepat. Dengan demikian, beberapa metode memungkinkan untuk menghasilkan sejumlah besar tanda penanda independen, tetapi pada saat yang sama memiliki reproduktifitas rendah dan sangat bergantung pada reagen yang digunakan, kondisi reaksi, dan kontaminasi bahan yang diteliti. Oleh karena itu, dalam setiap studi sekelompok galur, perlu menggunakan beberapa isolat standar (referensi), tetapi bahkan dalam kasus ini, hasil dari beberapa percobaan sangat sulit untuk digabungkan.
Kelompok metode ini termasuk RAPD, AFLP, InterSSR, InterSINE PCR. Setelah amplifikasi, sejumlah besar fragmen DNA dengan ukuran berbeda diperoleh. Disarankan untuk menggunakan teknik tersebut jika perlu untuk menetapkan perbedaan antara galur yang berkerabat dekat (induk-keturunan, mutan tipe liar, dll.), atau dalam kasus di mana analisis rinci dari sampel kecil diperlukan. Dengan demikian, metode AFLP banyak digunakan dalam pemetaan genetik P. infestans (van der Lee et al., 1997) dan dalam studi intrapopulasi (Knapova, Gisi, 2002, Cooke et al, 2003, Flier et al, 2003). Metode seperti itu tidak tepat untuk digunakan saat membuat database strain, karena praktis tidak mungkin untuk menyatukan penghitungan hasil ketika melakukan analisis di laboratorium yang berbeda.
Terlepas dari kesederhanaan dan kecepatan eksekusi yang tampak (isolasi DNA tanpa pemurnian, amplifikasi, visualisasi hasil yang baik), kelompok metode ini memerlukan penggunaan metode khusus untuk mendokumentasikan hasil: distilasi dalam gel poliakrilamida dengan label (radioaktif atau luminescent) primer dan paparan selanjutnya terhadap cahaya atau bahan radioaktif. Pencitraan gel agarosa etidium bromida konvensional umumnya tidak cocok untuk metode ini karena: sejumlah besar fragmen DNA dengan ukuran berbeda dapat menyatu.
Metode lain, sebaliknya, memungkinkan untuk menghasilkan sejumlah kecil fitur dengan reproduktifitas yang sangat tinggi. Kelompok ini mencakup studi haplotipe DNA mitokondria (hanya dua haplotipe Ia dan IIa yang tercatat di Rusia), tipe kawin (sebagian besar isolat dibagi lagi menjadi 2 tipe: A1 dan A2, SF yang subur sendiri jarang ditemukan) dan spektrum isozim peptidase ( dua lokus Pep1 dan Pep2 , masing-masing terdiri dari dua isozim) dan isomerase glukosa-6-fosfat (di Rusia tidak ada variabilitas dalam sifat ini, meskipun polimorfisme yang signifikan dicatat di negara-negara lain di dunia). Disarankan untuk menggunakan fitur ini saat menganalisis koleksi, menyusun basis data regional dan global. Dalam kasus analisis isozim dan haplotipe DNA mitokondria, dimungkinkan untuk dilakukan tanpa strain standar sama sekali, sedangkan analisis tipe perkawinan memerlukan dua isolat uji dengan tipe perkawinan yang diketahui.
Kondisi reaksi dan reagen hanya dapat mempengaruhi kontras produk pada elektroforetogram; manifestasi artefak dalam jenis studi ini tidak mungkin.
Saat ini, mayoritas populasi di Rusia bagian Eropa diwakili oleh strain kedua jenis kawin (Tabel 6), di antaranya ada isolat DNA mitokondria tipe Ia dan IIa (jenis mtDNA lain yang ditemukan di dunia tidak ditemukan di Rusia setelah 1993). Spektrum isozim peptidase diwakili oleh dua genotipe di lokus Pep1 (100/100, 92/92 dan heterozigot 92/100, dan genotipe 92/92 sangat jarang (<0,3%)) dan oleh dua genotipe di Pep 2 lokus (100/100 , 112/112 dan heterozigot 100/112, dengan genotipe 112/112 terjadi lebih jarang dari 100/100, tetapi juga cukup sering).
Tidak ada variabilitas dalam spektrum isoenzim glukosa-6-fosfat isomerase setelah 1993 (hilangnya garis klonal US-1); semua isolat yang diteliti memiliki genotipe 100/100 (Elansky dan Smirnov, 2002).
Kelompok metode ketiga memungkinkan memperoleh kelompok fitur penanda independen yang memadai dengan reproduktifitas tinggi. Saat ini, kelompok ini mencakup probe RFLP-RG57, yang menghasilkan 25-29 fragmen DNA dengan ukuran berbeda. RFLP-RG57 dapat digunakan baik saat menganalisis sampel maupun kompilasi database. Namun, metode ini jauh lebih mahal daripada yang sebelumnya, memakan waktu, dan membutuhkan sejumlah besar DNA yang sangat murni. Oleh karena itu, peneliti terpaksa membatasi volume materi yang diujikan.
Pengembangan RFLP-RG57 pada awal 90-an abad terakhir secara signifikan mengintensifkan studi populasi agen penyebab penyakit busuk daun. Ini menjadi dasar metode berdasarkan pemilihan dan analisis "Garis klon" (lihat di bawah). Seiring dengan RFLP-RG57, tipe kawin, sidik jari DNA (metode RFLP-RG57), spektrum isoenzim isomerase peptidase dan glukosa-6-fosfat, dan tipe DNA mitokondria digunakan untuk mengidentifikasi garis klon. Berkat dia, ditunjukkan al., 1994), penggantian populasi lama dengan yang baru (Drenth et al, 1993, Sujkowski et al, 1994, Goodwin et al, 1995a), mengidentifikasi galur klon yang lazim di banyak negara di dunia. Studi galur Rusia menggunakan metode ini menunjukkan polimorfisme genotip tinggi galur bagian Eropa dan monomorfisme populasi bagian Asia dan Timur Jauh Rusia (Elansky et al, 2001). Dan sekarang metode ini tetap menjadi yang utama dalam studi populasi P. infestans. Namun, penyebarannya yang luas terhambat oleh biaya yang cukup tinggi dan intensitas tenaga kerja dalam pelaksanaannya.
Teknik menjanjikan lainnya yang jarang digunakan dalam penelitian P. infestans adalah analisis microsatelite repeat (SSR). Saat ini, metode ini banyak digunakan untuk mengisolasi galur klon. Untuk analisis galur, sifat penanda fenotipik seperti keberadaan gen virulensi untuk varietas kentang (Avdey, 1995, Ivanyuk et al., 2002, Ulanova et al., 2003) dan tomat banyak digunakan (dan terus digunakan) . Saat ini, gen virulensi untuk varietas kentang telah kehilangan nilainya sebagai sifat penanda untuk studi populasi karena munculnya jumlah maksimum (atau mendekati) gen virulensi pada sebagian besar isolat. Pada saat yang sama, gen virulensi T1 untuk varietas tomat yang membawa gen Ph1 yang sesuai masih berhasil digunakan sebagai sifat penanda (Lavrova et al., 2003; Ulanova et al., 2003).
Dalam banyak karya, resistensi terhadap fungisida digunakan sebagai penanda sifat. Sifat ini tidak diinginkan untuk digunakan dalam studi populasi karena kemunculan mutasi resistensi yang agak mudah pada galur klonal setelah aplikasi fungisida yang mengandung metalaksil (atau mefenoxam-) di lapangan. Misalnya, perbedaan yang signifikan dalam tingkat resistensi telah ditunjukkan dalam garis klon Sib1 (Elansky et al., 2001).
Jadi, tipe kawin, spektrum isozim peptidase, tipe DNA mitokondria, RFLP-RG57, SSR adalah fitur penanda yang disukai untuk membuat bank data dan memberi label strain dalam koleksi. Untuk membandingkan sampel terbatas, jika perlu menggunakan jumlah maksimum fitur penanda, Anda dapat menggunakan AFLP, RAPD, InterSSR, Inter-SINE PCR (Tabel 5). Namun, harus diingat bahwa metode ini tidak dapat direproduksi dengan baik, dan dalam setiap percobaan individu (siklus elektroforesis amplifikasi) perlu menggunakan beberapa isolat referensi.
Tabel 5. Perbandingan berbagai metode penelitian galur P. infestans
kriterium | TC | polisi isofer | MtDNA | RFLP-RG57 | RAPD | ISSR | SSR | AFLP | Putaran |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
jumlah informasi | Н | Н | Н | С | В | В | С | В | В |
Reproduksibilitas | В | В | В | В | Н | Н | С | С | С |
Kemungkinan artefak | Н | Н | Н | Н | В | С | Н | С | В |
Biaya | Н | С | Н | В | Н | Н | Н | С | Н |
Intensitas tenaga kerja | Н | Н | Н | В | NS* | NS* | Н | С | NS* |
Kecepatan analisis ** | В | Н | Н | С | Н | Н | Н | Н | Н |
Catatan: H - rendah, C - sedang, B - tinggi; * - Intensitas tenaga kerja rendah saat menggunakan gel agarose atau otomatis
genotipe, medium - ketika disuling dalam gel poliakrilamida dengan primer berlabel,
** - tidak termasuk waktu yang dihabiskan untuk pertumbuhan miselium untuk isolasi DNA.
Struktur populasi
Garis klon
Dengan tidak adanya rekombinasi atau dengan kontribusinya yang tidak signifikan terhadap struktur populasi, populasi terdiri dari sejumlah klon tertentu, pertukaran genetik di antaranya sangat jarang.
Dalam populasi seperti itu, lebih informatif untuk mempelajari bukan frekuensi gen individu, tetapi frekuensi genotipe yang memiliki asal yang sama (garis klon atau garis keturunan klon) dan berbeda hanya dengan mutasi titik. Studi populasi patogen penyakit busuk daun dan analisis garis klon telah meningkat secara signifikan sejak munculnya metode RFLP-RG57 pada awal 90-an abad terakhir. Seiring dengan RFLP-RG57, tipe kawin, spektrum isoenzim peptidase dan glukosa-6-fosfat isomerase, dan tipe DNA mitokondria digunakan untuk mengidentifikasi garis klon. Karakteristik galur klon yang paling umum ditunjukkan pada Tabel 6.
Klon US-1 mendominasi populasi di mana-mana sampai akhir 80-an, setelah itu mulai digantikan oleh klon lain dan menghilang dari Eropa dan Amerika Utara. Sekarang ditemukan di Timur Jauh (Filipina, Taiwan, Cina, Jepang, Korea, Koh et al., 1994, Mosa et al, 1993), di Afrika (Uganda, Kenya, Rwanda, Goodwin et al, 1994, Vega- Sanchez et al., 2000; Ochwo et al., 2002) dan di Amerika Selatan (Ekuador, Brasil, Peru, Forbes et al., 1997, Goodwin et al., 1994). Tidak ada strain milik garis US-1 telah diidentifikasi di Australia saja. Ternyata, isolat P. infestans datang ke Australia dengan gelombang migrasi yang lain (Goodwin, 1997).
Klon US-6 bermigrasi dari Meksiko utara ke California pada akhir 70-an dan menyebabkan epidemi di kentang dan tomat setelah 32 tahun tanpa penyakit. Karena agresivitasnya yang tinggi, ia menggantikan klon US-1 dan mulai mendominasi pantai barat Amerika Serikat (Goodwin et al., 1995a).
Genotipe US-7 dan US-8 ditemukan di Amerika Serikat pada tahun 1992 dan sudah pada tahun 1994 didistribusikan secara luas di Amerika Serikat dan Kanada. Selama satu musim tanam, klon US-8 hampir dapat menggantikan klon US-1 di petak-petak kentang yang awalnya terinfeksi kedua klon pada konsentrasi yang sama (Miller dan Johnson, 2000).
Klon BC-1 hingga BC-4 telah diidentifikasi di British Columbia dalam sejumlah kecil isolat dari Goodwin et al., 1995b). Klon US-11 menyebar luas di Amerika Serikat dan menggantikan US-1 di Taiwan. Klon JP-1 dan EC-1, bersama dengan kloning US-1, adalah umum di Jepang dan Ekuador, masing-masing (Koh et al., 1994; Forbes et al., 1997).
SIB-1 adalah tiruan yang berlaku di Rusia atas wilayah yang luas dari wilayah Moskow hingga Sakhalin. Di wilayah Moskow, ditemukan pada tahun 1993, dan beberapa populasi lapangan terutama terdiri dari galur garis klon ini, sangat tahan terhadap metalaksil. Setelah tahun 1993, prevalensi klon ini menurun secara signifikan. Di luar Ural pada 1997-1998, SIB-1 ditemukan di mana-mana, kecuali Wilayah Khabarovsk (klon SIB-2 tersebar luas di sana). Pemisahan spasial klon dengan berbagai jenis perkawinan tidak termasuk proses seksual di Siberia dan Timur Jauh. Di wilayah Moskow, berbeda dengan Siberia, populasi diwakili oleh banyak klon; hampir setiap isolat memiliki genotipe multilokus yang unik (Elansky et al., 2001, 2015). Keanekaragaman ini tidak dapat dijelaskan hanya dengan impor strain jamur dari berbagai belahan dunia dengan bahan benih impor. Karena kedua jenis perkawinan tersebut terjadi dalam populasi, kemungkinan keragamannya juga disebabkan oleh rekombinasi. Dengan demikian, di British Columbia, kemunculan genotipe BC-2, BC-3, dan BC-4 diasumsikan karena hibridisasi klon BC-1 dan US-6 (Goodwin et al., 1995b). Ada kemungkinan bahwa galur hibrida ditemukan di populasi Moskow. Misalnya, strain MO-4, MO-8, dan MO-11 heterozigot untuk lokus PEP dapat menjadi hibrida antara strain MO-12, MO-21, MO-22, memiliki tipe pasangan A2 dan homozigot untuk satu alel dari Lokus PEP dan strain MO-8, memiliki tipe kawin A1 dan homozigot untuk alel lokus lain. Dan jika demikian, dan pada populasi modern P. infestans terdapat kecenderungan peningkatan peran proses seksual, maka nilai informasi analisis klon multilokus akan menurun (Elansky et al., 2001, 2015). ).
Variasi dalam garis klon
Hingga tahun 90-an abad ke-20, garis klon US-1 tersebar luas di dunia. Sebagian besar populasi lapangan dan regional secara eksklusif terdiri dari galur dengan genotipe US-1. Namun, perbedaan antara isolat juga diamati, kemungkinan besar disebabkan oleh proses mutasi. Mutasi terjadi pada DNA nukleus dan mitokondria dan mempengaruhi, antara lain, tingkat resistensi terhadap obat fenilamid dan jumlah gen virulensi. Garis yang berbeda dari genotipe asli dengan mutasi ditunjukkan dengan nomor tambahan setelah titik di belakang nama genotipe asli (misalnya, garis mutan US-1.1 dari garis klon US-1). Garis DNA sidik jari US-1.5 dan US-1.6 mengandung garis aksesori dengan ukuran berbeda (Goodwin et al., 1995a, 1995b); garis klon US-6.3 juga berbeda dari US-6 dalam satu garis aksesori (Goodwin, 1997, Tabel 7).
Dalam studi DNA mitokondria, ditemukan bahwa hanya DNA mitokondria tipe 1b yang ditemukan pada garis klonal US-1 (Carter et al., 1990). Namun, dalam studi galur galur klonal ini dari Peru dan Filipina, isolat dicatat, jenis DNA mitokondrianya berbeda dari 1b dengan adanya penyisipan dan penghapusan (Goodwin, 1991, Koh et al., 1994) .
Tabel 6. Genotipe multilokus dari beberapa galur klon P. infestans
Nama | Jenis kawin | isozim | sidik jari DNA | Tipe MtDNA | |
GPI | PEP | ||||
AS-1 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111010110011E + 24 | Ib |
AS-2 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111010010011E + 24 | - |
AS-3 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111000000011E + 24 | - |
AS-4 | A1 | 100/100 | 92/92 | 1.0111010010011E + 24 | - |
AS-5 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0111010010011E + 24 | - |
AS-6 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0111110010011E + 24 | IIb |
AS-7 | A2 | 100/111 | 100/100 | 1.0011000010011E + 24 | Ia |
AS-8 | A2 | 100/111/122 | 100/100 | 1.0011000010011E + 24 | Ia |
AS-9 | A1 | 100/100 | 83/100 | * | - |
AS-10 | A2 | 111/122 | 100/100 | - | - |
AS-11 | A1 | 100/111 | 92/100 | 1.0101110010011E + 24 | IIb |
AS-12 | A1 | 100/111 | 92/100 | 1.0001000010011E + 24 | - |
AS-14 | A2 | 100/122 | 100/100 | 1.0000000000011E + 24 | - |
AS-15 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011E + 24 | Ia |
AS-16 | A1 | 100/111 | 100/100 | 1.0001100010011E + 24 | - |
AS-17 | A1 | 100/122 | 100/100 | 1.0100010000011E + 24 | - |
AS-18 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011E + 24 | Ia |
AS-19 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0101010000011E + 24 | Ia |
EC-1 | A1 | 90/100 | 96/100 | 1.1111010010011E + 24 | IIa |
SIB-1 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000110011E + 24 | IIa |
SIB-2 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000010011E + 24 | IIa |
SIB-3 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.1001010100011E + 24 | IIa |
MO-1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000110011E + 24 | IIa |
MO-2 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000010011E + 24 | Ia |
MO-3 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101000010011E + 24 | IIa |
MO-4 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0101110110011E + 24 | IIa |
MO-5 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001010010011E + 24 | IIa |
MO-6 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010010011E + 24 | Ia |
MO-7 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000110011E + 24 | IIa |
MO-8 | A1 | 100/100 | 92/92 | 1.0101100010011E + 24 | IIa |
MO-9 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011E + 24 | IIa |
MO-10 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101100000011E + 24 | Ia |
MO-11 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0101010010011E + 24 | Ia |
MO-12 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010010011E + 24 | Ia |
MO-13 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011E + 24 | Ia |
MO-14 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.01010010011E + 22 | Ia |
MO-15 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.101110010011E + 23 | Ia |
MO-16 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000000011E + 24 | IIa |
MO-17 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1.0101010110011E + 24 | Ib |
MO-18 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101110010011E + 24 | IIa |
MO-19 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011E + 24 | IIa |
MO-20 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011E + 24 | IIa |
MO-21 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011E + 24 | IIa |
Catatan: * - tidak ada data.
Tabel 7. Genotipe multilokus dan galur mutannya
Nama | Jenis kawin | | Sidik Jari DNA (RG57) | Catatan | |
GPI | PEP-1 | ||||
AS-1 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101011001101000110011 | Genotipe asli 1 |
AS-1.1 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1011101011001101000110011 | Mutasi pada PEP |
AS-1.2 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101010001101000110011 | Mutasi di RG57 |
AS-1.3 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101001001101000110011 | Mutasi di RG57 |
AS-1.4 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1011101010001101000110011 | Mutasi pada RG57 dan PEP |
AS-1.5 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101011001101010110011 | Mutasi di RG57 |
AS-6 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001001100010110011 | Genotipe asli 2 |
AS-6.1 | A1 | 100/100 | 92 /92 | 1011111001001100010110011 | Mutasi pada PEP |
AS-6.2 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011101001001100010110011 | Mutasi di RG57 |
AS-6.3 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001011100010110011 | Mutasi di RG57 |
AS-6.4 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1011011001001100010110011 | Mutasi pada RG57 dan PEP |
AS-6.5 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001001100010010011 | Mutasi di RG57 |
BR-1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1011101000001100001111011 | Genotipe asli 3 |
BR-1.1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1010101000001100001110011 | Mutasi di RG57 |
Ada juga perubahan dalam spektrum isozim. Sebagai aturan, mereka disebabkan oleh pemecahan suatu organisme yang awalnya heterozigot untuk enzim ini menjadi yang homozigot. Pada tahun 1993, pada buah tomat, kami mengidentifikasi galur dengan karakteristik karakteristik US-1: sidik jari RG57, tipe DNA mitokondria dan genotipe 86/100 untuk glukosa-6-fosfat-isomerase, tetapi homozigot (100/100) untuk lokus peptidase pertama, bukan heterozigot 92/100 yang khas dari garis klon ini. Kami menamai genotipe galur ini MO-17 (Tabel 6). Garis mutan US-1.1 dan US-1.4 juga berbeda dari US-1 oleh mutasi pada lokus peptidase pertama (Tabel 7).
Mutasi yang menyebabkan perubahan jumlah gen virulensi untuk varietas kentang dan tomat cukup umum. Mereka tercatat di antara isolat galur klonal US-1 dalam populasi dari Belanda (Drenth et al., 1994), Peru (Goodwin et al., 1995a), Polandia (Sujkowski et al., 1991), Amerika Utara bagian utara ( Goodwin dkk., ., 1995b). Perbedaan jumlah gen virulensi kentang juga dicatat antara isolat galur klon US-7 dan US-8 di Kanada dan Amerika Serikat (Goodwin et al., 1995a), di antara isolat galur SIB-1 di Asia. bagian dari Rusia (Elansky et al, 2001).
Isolat dengan perbedaan yang kuat dalam tingkat resistensi terhadap obat fenilamid diidentifikasi dalam populasi lapangan monoklonal, yang semuanya milik garis klon Sib-1 (Elansky et al, 2001, Tabel 1). Hampir semua galur galur klonal US-1 sangat rentan terhadap metalaksil; namun, isolat galur ini yang sangat resisten diisolasi di Filipina (Koh et al., 1994) dan di Irlandia (Goodwin et al., 1996).
Populasi modern P. infestans
Amerika Tengah (Meksiko)
Populasi P. infestans di Meksiko sangat berbeda dari populasi dunia lainnya, terutama karena posisi historisnya. Sejumlah penelitian tentang populasi ini dan spesies P. infestans terkait dari clade Phytophthora, serta spesies lokal dari genus Solanum, menghasilkan kesimpulan bahwa evolusi patogen di bagian tengah Meksiko terjadi bersamaan dengan evolusi inang. tanaman dan dikaitkan dengan rekombinasi seksual (Grünwald, Flier, 2005). Kedua jenis perkawinan diwakili dalam populasi, dan dalam proporsi yang sama, dan keberadaan oospora di tanah, pada tanaman dan umbi kentang dan spesies Solanum terkait liar menegaskan adanya proses seksual dalam populasi (Fernández-Pavía et al., 2002). Studi terbaru dari Lembah Toluca dan sekitarnya (pusat dugaan asal patogen) mengkonfirmasi keragaman genetik yang tinggi dari populasi lokal P. infestans (134 genotipe multilokus dalam sampel dari 176 sampel) dan adanya beberapa subpopulasi yang berbeda di wilayah tersebut (Wang et al., 2017). Faktor-faktor yang berkontribusi terhadap diferensiasi ini adalah pembagian spasial subpopulasi yang menjadi ciri dataran tinggi Meksiko tengah, perbedaan kondisi budidaya dan varietas kentang yang digunakan di lembah dan pegunungan, dan keberadaan spesies Solanum berbonggol liar yang dapat bertindak sebagai inang alternatif (Fry et al. ., 2009).
Namun, perlu dicatat bahwa populasi P. infestans di Meksiko utara lebih bersifat klonal dan lebih mirip dengan populasi Amerika Utara, yang dapat mengindikasikan bahwa ini adalah genotipe baru (Fry et al., 2009).
Amerika utara
Populasi P. infestans di Amerika Utara selalu memiliki struktur yang sangat sederhana dan karakter klonnya telah terbentuk jauh sebelum analisis mikrosatelit digunakan. Hingga tahun 1987, galur klonal US-1 mendominasi di Amerika Serikat dan Kanada (Goodwin et al., 1995). Pada pertengahan 70-an, ketika fungisida berbasis metalaksil muncul, klon ini mulai digantikan oleh genotipe lain yang lebih tahan yang bermigrasi dari Meksiko (Goodwin et al., 1998). Menjelang akhir tahun 90-an. genotipe US-8 sepenuhnya menggantikan genotipe US-1 di Amerika Serikat dan menjadi galur klon dominan pada kentang (Fry et al., 2009; Fry et al., 2015). Situasi berbeda terjadi pada tomat, yang secara konstan mengandung beberapa galur klon, dan komposisinya berubah dari tahun ke tahun (Fry et al., 2009).
Pada tahun 2009, epidemi penyakit busuk daun berskala besar terjadi di Amerika Serikat pada tomat. Ciri dari pandemi ini adalah kemunculannya yang hampir bersamaan di banyak tempat di Amerika Serikat bagian timur laut, dan ternyata terkait dengan penjualan besar-besaran bibit tomat yang terinfeksi di pusat-pusat kebun besar (Fry et al., 2013). Kerugian panen sangat besar. Analisis mikrosatelit dari sampel yang terkena menunjukkan bahwa strain pandemi milik garis klonal tipe US-22 A2 kawin. Pada tahun 2009, pangsa genotipe ini pada populasi P. infestans di Amerika mencapai 80% (Fry et al., 2013). Pada tahun-tahun berikutnya, proporsi genotipe agresif US-23 (terutama pada tomat) dan US-24 (pada kentang) terus meningkat dalam populasi, namun, setelah 2011, tingkat deteksi US-24 menurun secara signifikan, dan hingga saat ini, sekitar 90% populasi patogen di Amerika Serikat diwakili oleh genotipe US-23 (Fry et al., 2015).
Di Kanada, seperti di Amerika Serikat, pada akhir tahun 90-an. genotipe dominan US-1 digantikan oleh US-8, posisi dominan yang tetap tidak berubah sampai 2008. Di Kanada, ada epidemi penyakit busuk daun yang serius terkait dengan penjualan bibit tomat yang terinfeksi, tetapi penyakit tersebut disebabkan oleh genotipe US-2009 dan US-2010 (Kalischuk et al., 23). Diferensiasi geografis yang jelas dari genotipe ini ternyata luar biasa: US-8 mendominasi provinsi barat Kanada (2012%), sedangkan US-23 mendominasi provinsi timur (68%). Pada tahun-tahun berikutnya, US-8 menyebar ke wilayah timur; namun, secara umum, bagiannya dalam populasi sedikit menurun dengan latar belakang munculnya genotipe US-83 dan US-23 di negara tersebut (Peters et al., 22). Sampai saat ini, US-24 mempertahankan posisi dominan di seluruh Kanada; US-2014 hadir di British Columbia, sedangkan US-23 dan US-8 hadir di Ontario (Peters, 23).
Dengan demikian, populasi P. infestans di Amerika Utara sebagian besar merupakan galur klonal. Selama 40 tahun terakhir, jumlah genotipe klon yang terdeteksi telah mencapai 24. Terlepas dari kenyataan bahwa strain dari kedua jenis perkawinan hadir dalam populasi, kemungkinan munculnya genotipe baru sebagai hasil rekombinasi seksual tetap agak rendah. Namun demikian, dalam 20 tahun terakhir, beberapa kasus kemunculan populasi rekombinan sementara telah dicatat (Gavino et al., 2000; Danies et al., 2014; Peters et al., 2014), dan dalam satu kasus, hasilnya persilangan adalah genotipe US-11 , yang bercokol di Amerika Utara selama bertahun-tahun (Gavino et al., 2000). Hingga 2009, perubahan struktur populasi dikaitkan dengan munculnya genotipe baru yang lebih agresif dengan migrasi berikutnya dan perpindahan pendahulu yang sebelumnya dominan. Apa yang terjadi pada 2009-2010 Di Amerika Serikat dan Kanada, epifitosis untuk pertama kalinya menunjukkan bahwa di era globalisasi, wabah penyakit dapat dikaitkan dengan penyebaran aktif genotipe baru saat menjual bahan tanam yang terinfeksi.
Amerika Selatan
Sampai saat ini, penelitian populasi P. infestans di Amerika Selatan tidak dilakukan secara reguler maupun berskala besar. Diketahui bahwa struktur populasi ini cukup sederhana dan mencakup 1-5 garis keturunan klon per negara (Forbes et al., 1998). Jadi, pada tahun 1998, genotipe US-1 (Brasil, Chili) BR-1 (Brasil, Bolivia, Uruguay, Paraguay), EC-1 (Ekuador, Kolombia, Peru dan Venezuela), AR-1, AR -2, AR- 3, AR-4 dan AR-5 (Argentina), PE-3 dan PE-7 (Peru selatan). Kawin tipe A2 hadir di Brasil, Bolivia dan Argentina dan tidak ditemukan di luar perbatasan Bolivia-Peru di daerah Danau Titicaca, di mana genotipe EC-1 A1 mendominasi di Andes. Pada tomat, US-1 tetap menjadi genotipe dominan di seluruh Amerika Selatan.
Situasi ini kurang lebih bertahan di tahun 2000-an. Poin penting adalah penemuan galur klonal baru EC-2 tipe A2 pada kerabat liar kentang (S. brevifolium dan S. tetrapetalum) di Andes Utara (Oliva et al., 2010). Studi filogenetik telah menunjukkan bahwa galur ini tidak sepenuhnya identik dengan P. infestans, meskipun terkait erat dengannya, sehubungan dengan itu diusulkan untuk mempertimbangkannya, serta galur lain, EC-3, diisolasi dari pohon tomat. S. betaceum tumbuh di Andes, spesies baru yang disebut P. andina; namun status spesies ini (spesies independen atau hibrida P. infestans dengan beberapa galur yang masih belum diketahui) masih belum jelas (Delgado et al., 2013).
Saat ini, semua populasi P. infestans di Amerika Selatan adalah klon. Meskipun kehadiran kedua jenis perkawinan, tidak ada populasi rekombinan yang telah diidentifikasi. Pada tomat, genotipe US-1 ada di mana-mana, tampaknya digantikan dari kentang oleh galur lokal, yang asal pastinya masih belum diketahui. Genotipe BR-1 terdapat di Brazil, Bolivia dan Uruguay; di Peru, bersama dengan US-1 dan EC-1, ada beberapa genotipe lokal lainnya. Di Andes, posisi dominan dipertahankan oleh garis klonal EC-1, yang hubungannya dengan P. andina yang baru ditemukan masih belum diselidiki. Satu-satunya tempat yang "tidak stabil" untuk periode 2003-2013. terjadi perubahan populasi yang signifikan, menjadi Chili (Acuña et al., 2012), dimana pada tahun 2004-2005. populasi patogen menjadi dicirikan oleh resistensi terhadap metalaksil dan haplotipe DNA mitokondria baru (Ia bukannya Ib yang ada sebelumnya). 2006 hingga 2011 Dalam populasi, genotipe 21 (menurut SSR) mendominasi, pangsanya mencapai 90%, setelah itu sawit beralih ke genotipe 20, frekuensi kemunculannya dalam dua tahun berikutnya dipertahankan sekitar 67% (Acuña, 2015).
Eropa
Dalam sejarah Eropa, setidaknya ada dua gelombang migrasi P. infestans dari Amerika Utara: pada abad ke-1. (HERB-1) dan awal abad kedua puluh (US-70). Distribusi luas fungisida yang mengandung metalaksil di tahun 1-an. menyebabkan perpindahan genotipe dominan US-XNUMX dan penggantiannya dengan genotipe baru. Akibatnya, di sebagian besar negara Eropa Barat, populasi patogen diwakili terutama oleh beberapa galur klon.
Penggunaan analisis mikrosatelit untuk analisis populasi patogen memungkinkan untuk mengungkapkan perubahan serius yang terjadi di Eropa Barat pada tahun 2005-2008. Pada tahun 2005, garis klon baru ditemukan di Inggris, yang disebut 13_A2 (atau "Blue 13" ) dan dicirikan oleh tipe kawin A2, agresivitas tinggi dan ketahanan terhadap fenilamid (Shaw et al., 2007). Genotipe yang sama ditemukan dalam sampel yang dikumpulkan pada tahun 2004 di Belanda dan Prancis utara, yang menunjukkan bahwa ia bermigrasi ke Inggris dari benua Eropa, mungkin dengan kentang benih (Cooke et al., 2007). Studi genom perwakilan garis klon ini menunjukkan tingkat polimorfisme yang tinggi dari urutannya (pada 2016, jumlah variasi subklonalnya mencapai 340) dan tingkat variasi yang signifikan dalam tingkat ekspresi gen, termasuk. gen efektor selama infeksi tanaman (Cooke et al., 2012; Cooke, 2017). Ciri-ciri ini, bersama dengan peningkatan durasi fase biotrofik, dapat menyebabkan peningkatan agresivitas 13_A2 dan kemampuannya untuk menginfeksi bahkan varietas kentang yang tahan terhadap penyakit busuk daun.
Dalam beberapa tahun ke depan, genotipe dengan cepat menyebar di negara-negara Eropa Barat Laut (Inggris Raya, Irlandia, Prancis, Belgia, Belanda, Jerman) dengan perpindahan simultan dari genotipe yang sebelumnya dominan 1_A1, 2_A1, 8_A1 (Montarry et al. , 2010; Gisi dkk., 2011; Van den Bosch dkk., 2011; Cooke, 2015; Cooke, 2017). Menurut situs web www.euroblight.net, pangsa 13_A2 dalam populasi negara-negara ini mencapai 60-80% dan lebih banyak lagi; keberadaan genotipe ini juga tercatat di beberapa negara Eropa Timur dan Selatan. Namun, pada 2009-2012. 13_A2 kehilangan posisi dominannya di Inggris Raya dan Prancis, menghasilkan garis 6_A1 (8_A1 di Irlandia), dan di Belanda dan Belgia sebagian digantikan oleh genotipe 1_A1, 6_A1, dan 33_A2 (Cooke et al., 2012; Cooke, 2017; Stellingwerf, 2017).
Sampai saat ini, sekitar 70% populasi P. infestans Eropa Barat adalah monoklonal. Menurut situs web www.euroblight.net, genotipe dominan di negara-negara Eropa Barat Laut (Inggris, Prancis,
Belanda, Belgia) tetap, dalam proporsi yang kira-kira sama, 13_A2 dan 6_A1, yang terakhir praktis tidak ditemukan di luar wilayah yang ditentukan (dengan pengecualian Irlandia), tetapi sudah memiliki setidaknya 58 subklon (Cooke, 2017). Variasi 13_A2 hadir dalam jumlah yang nyata di Jerman, dan juga diamati secara sporadis di negara-negara Eropa Tengah dan Selatan. Genotipe 1_A1 merupakan bagian penting dari populasi Belgia dan sebagian Belanda dan Prancis. Genotipe 8_A1 telah stabil di populasi Eropa pada level 3-6%, dengan pengecualian Irlandia, di mana ia mempertahankan posisi terdepan dan dibagi menjadi dua subklon (Stellingwerf, 2017). Terakhir, pada tahun 2016, terjadi peningkatan frekuensi kemunculan genotipe baru 36_A2 dan 37_A2, pertama kali tercatat pada tahun 2013-2014; hingga saat ini, genotipe tersebut ditemukan di Belanda dan Belgia dan sebagian di Prancis dan Jerman, serta di Inggris Raya bagian selatan (Cooke, 2017). Sekitar 20-30% dari populasi Eropa Barat setiap tahun diwakili oleh genotipe yang unik.
Tidak seperti Eropa Barat, pada saat genotipe 13_A2 muncul, populasi Eropa Utara (Swedia, Norwegia, Denmark, Finlandia) tidak diwakili oleh garis klon, tetapi oleh sejumlah besar genotipe unik (Brurberg et al.,
2011). Selama periode penyebaran aktif 13_A2 di Eropa Barat, keberadaan genotipe ini di Skandinavia tidak diamati sampai 2011, ketika pertama kali ditemukan di Jutland Utara (Denmark), di mana terutama varietas kentang industri ditanam dengan penggunaan aktif metalaksil. -yang mengandung fungisida (Nielsen et al., 2014). Menurut www.euroblight.net, genotipe 13_A2 juga terdeteksi pada beberapa sampel dari Norwegia dan Denmark pada tahun 2014 dan pada beberapa sampel Norwegia pada tahun 2016; selain itu, pada tahun 2013 di Finlandia, sejumlah kecil genotipe 6_A1 diamati. Alasan utama kegagalan 13_A2 dan garis klon lainnya dalam penaklukan Skandinavia dianggap sebagai perbedaan iklim wilayah ini dari negara-negara Eropa Barat.
Selain fakta bahwa musim panas yang sejuk dan musim dingin yang dingin mendorong kelangsungan hidup miselium vegetatif yang tidak sebanyak oospora (Sjöholm et al., 2013), pembekuan tanah di musim dingin (yang biasanya tidak terjadi di negara-negara Eropa Barat yang lebih hangat) berkontribusi terhadap sinkronisasi perkecambahan oospora dan penanaman kentang, yang meningkatkan perannya sebagai sumber infeksi primer (Brurberg et al., 2011). Perlu juga dicatat bahwa, dalam kondisi utara, perkembangan infeksi dari oospora melampaui perkembangan infeksi tuberous, yang pada akhirnya mencegah dominasi garis klon yang lebih agresif, tetapi kemudian berkembang (Yuen, 2012). Struktur populasi P. infestans yang paling banyak dipelajari di Eropa Timur (Polandia, Negara Baltik) sangat mirip dengan di Skandinavia.
Kedua jenis perkawinan juga ada di sini, dan sebagian besar genotipe yang ditentukan oleh analisis SSR adalah unik (Chmielarz et al., 2014; Runno-Paurson et al., 2016). Seperti di Eropa Utara, penyebaran galur klon (terutama genotipe 13_A2) praktis tidak mempengaruhi populasi lokal patogen, yang mempertahankan tingkat keragaman yang tinggi dengan tidak adanya garis dominan yang jelas.
Kehadiran 13_A2 kadang-kadang diamati di ladang dengan varietas kentang komersial. Di Rusia, situasinya berkembang dengan cara yang sama. Analisis mikrosatelit dari isolat P. infestans yang dikumpulkan pada tahun 2008-2011 di 10 wilayah berbeda di bagian Eropa Rusia, menunjukkan tingkat keragaman genotip yang tinggi dan sama sekali tidak kebetulan dengan garis klon Eropa (Statsyuk et al., 2014). Beberapa tahun kemudian, penelitian sampel P. infestans yang dikumpulkan di wilayah Leningrad pada tahun 2013-2014 menunjukkan perbedaan yang signifikan antara mereka dan genotipe dari wilayah ini yang diidentifikasi pada penelitian sebelumnya. Dalam kedua penelitian, tidak ada genotipe Eropa Barat yang ditemukan (Beketova et al., 2014; Kuznetsova et al., 2016).
Keragaman genetik yang tinggi dari populasi P. infestans Eropa Timur dan tidak adanya garis klon dominan di dalamnya mungkin disebabkan oleh beberapa alasan. Pertama, seperti di Eropa Utara, kondisi iklim negara-negara yang dipertimbangkan berkontribusi pada pembentukan oospora sebagai sumber utama infeksi (Ulanova et al., 2010; Chmielarz et al., 2014). Kedua, sebagian besar kentang yang diproduksi di negara-negara ini ditanam di pertanian swasta kecil, seringkali dikelilingi oleh hutan atau hambatan lain untuk pergerakan bebas bahan infeksius (Chmielarz et al., 2014). Sebagai aturan, kentang yang ditanam dalam kondisi seperti itu praktis tidak diperlakukan dengan bahan kimia, dan pilihan varietas didasarkan pada ketahanan penyakit busuk daunnya, mis. tidak ada tekanan selektif untuk agresivitas dan ketahanan terhadap metalaksil, yang menghilangkan keunggulan genotipe resisten, seperti 13_A2, dibandingkan genotipe lain (Chmielarz et al., 2014). Akhirnya, karena ukuran petak yang kecil, pemiliknya biasanya tidak melakukan rotasi tanaman, menanam kentang selama bertahun-tahun di tempat yang sama, yang berkontribusi pada akumulasi inokulum yang beragam secara genetik (Runno-Paurson et al., 2016; Elansky , 2015; Elansky dkk., 2015).
Asia
Sampai saat ini, struktur populasi P. infestans di Asia masih relatif kurang dipahami. Diketahui bahwa itu diwakili terutama oleh garis klon, dan efek rekombinasi seksual pada kemunculan genotipe baru sangat kecil. Jadi, misalnya, pada 1997-1998. Di bagian Asia Rusia (Siberia dan Timur Jauh), populasi patogen diwakili oleh hanya tiga genotipe dengan dominasi genotipe SIB-1 (Elansky et al., 2001). Kehadiran garis patogen klonal telah ditunjukkan di negara-negara seperti Cina, Jepang, Korea, Filipina, dan Taiwan (Koh et al., 1994; Chen et al., 2009). Garis klonal US-1 mendominasi sebagian besar wilayah Asia pada akhir 90-an - awal 2000-an. hampir di mana-mana mulai digantikan oleh genotipe lain, yang, pada gilirannya, memberi jalan kepada yang baru. Dalam kebanyakan kasus, perubahan struktur dan komposisi populasi di negara-negara Asia dikaitkan dengan migrasi genotipe baru dari luar. Jadi, di Jepang, kecuali genotipe JP-3, semua genotipe Jepang lainnya yang muncul setelah US-1 (JP-1, JP-2, JP-3) kurang lebih memiliki asal-usul eksternal yang terbukti (Akino et al. , 2011) ... Saat ini ada tiga populasi patogen utama di Cina, yang memiliki pembagian geografis yang jelas; aliran gen antara populasi ini tidak ada atau sangat lemah (Guo et al., 2010; Li et al., 2013b). Genotipe 13_A2 muncul di wilayah Cina di provinsi selatannya (Yunnan dan Sichuan) pada 2005-2007, dan pada 2012-1014. juga terlihat di timur laut negara itu (Li et al., 2013b). Di India, 13_A2 mungkin muncul bersamaan dengan di Cina, kemungkinan besar dengan kentang benih yang terinfeksi (Chowdappa et al., 2015), dan pada 2009-2010. menyebabkan epifitosis serius dari penyakit busuk daun pada tomat di selatan negara itu, setelah itu menyebar ke kentang dan pada tahun 2014 menyebabkan wabah penyakit busuk daun di Benggala Barat, yang menyebabkan kehancuran dan bunuh diri banyak petani lokal (Fry, 2016 ).
Африка
Sampai 2008-2010. studi sistematis P. infestans di negara-negara Afrika belum dilakukan. Saat ini, populasi P. infestans Afrika dapat dibagi menjadi dua kelompok, dan pembagian ini jelas terkait dengan fakta impor kentang benih dari Eropa.
Di Afrika Utara, yang secara aktif mengimpor kentang benih dari Eropa, jenis kawin A2 terwakili secara luas di hampir semua wilayah, yang memberikan kemungkinan teoretis munculnya genotipe baru sebagai hasil rekombinasi seksual (Corbière et al., 2010; Rekad. dkk., 2017). Selain itu, di Aljazair, keberadaan genotipe 13_A2, 2_A1, dan 23_A1 dicatat dengan dominasi yang jelas dari yang pertama, serta penurunan bertahap dalam proporsi genotipe unik hingga kepunahan total (Rekad et al., 2017 ). Tidak seperti wilayah lainnya, di Tunisia (dengan pengecualian timur laut negara itu), populasi patogen diwakili terutama oleh tipe kawin A1 (Harbaoui et al., 2014).
Garis klonal NA-01 dominan di sini. Secara umum proporsi galur klon dalam populasi hanya 43%. Di Afrika Timur dan Selatan, di mana volume impor benih semakin kecil (Fry et al., 2009), P. infestans diwakili oleh hanya dua galur tipe A1 klon, US-1 dan KE-1, dan yang terakhir aktif menggantikan yang pertama pada kentang (Pule et al., 2012; Njoroge et al., 2016). Sampai saat ini, kedua genotipe ini memiliki sejumlah variasi subklonal yang nyata.
Australia
Laporan pertama tentang manifestasi penyakit busuk daun pada kentang di Australia dimulai pada tahun 1907, dan epifitotia pertama, yang diduga disebabkan oleh hujan lebat di bulan-bulan musim panas, terjadi pada tahun 1909-1911. (Drenth et al., 2002). Namun, secara umum, penyakit busuk daun tidak memiliki signifikansi ekonomi yang signifikan bagi negara. Wabah sporadis penyakit busuk daun, dipicu oleh kondisi cuaca yang memberikan kelembaban tinggi, tidak terjadi lebih dari sekali setiap 5-7 tahun dan terlokalisasi terutama di Tasmania utara dan Victoria tengah. Sehubungan dengan hal tersebut di atas, praktis tidak ada publikasi yang dikhususkan untuk mempelajari struktur populasi P. infestans Australia. Informasi terbaru yang tersedia adalah dari tahun 1998-2000. (Drenth et al., 2002). Menurut penulis, populasi negara bagian Victoria adalah garis klonal US-1.3, yang secara tidak langsung mengkonfirmasi migrasi genotipe ini dari Amerika Serikat. Spesimen Tasmania diklasifikasikan sebagai tipe AU-3, berbeda dari genotipe yang ada pada waktu itu di bagian lain dunia.
Fitur pengembangan penyakit busuk daun di Rusia
Di Eropa, inokulum utama pada kentang dianggap sebagai infeksi yang dibawa oleh umbi benih yang sakit, oospora yang menahan musim dingin di tanah, serta zoosporangia yang dibawa oleh angin dari tanaman yang tumbuh dari umbi yang terlalu dingin di ladang tahun lalu (tanaman "sukarelawan"), atau pada tumpukan pembatas buku untuk penyimpanan umbi. Dari jumlah tersebut, tanaman yang ditanam di tumpukan umbi yang dibuang dianggap sebagai sumber infeksi yang paling berbahaya. di sana jumlah umbi yang bertunas sering kali signifikan, dan zoosporangia dapat dibawa dari jarak jauh. Sumber lainnya (oospora, tanaman "sukarela") tidak begitu berbahaya, karena bukan kebiasaan menanam tanaman di lahan yang sama lebih dari sekali setiap 3-4 tahun. Infeksi dari umbi benih yang sakit juga minimal karena sistem pengendalian mutu benih yang baik.
Secara umum, jumlah inokulum pada populasi Eropa terbatas, dan oleh karena itu pertumbuhan epidemi agak lambat dan dapat berhasil dikendalikan dengan menggunakan sediaan fungisida kimia. Tugas utama dalam kondisi Eropa adalah perang melawan infeksi pada fase ketika penyebaran massal zoosporangia dari tanaman yang terkena dimulai.
Di Rusia, situasinya sangat berbeda. Sebagian besar tanaman kentang dan tomat ditanam di kebun pribadi kecil; tindakan perlindungan sama sekali tidak dilakukan pada mereka, atau perawatan fungisida dilakukan dalam jumlah yang tidak mencukupi dan dimulai setelah munculnya penyakit busuk daun di bagian atas. Akibatnya, kebun sayur pribadi bertindak sebagai sumber utama infeksi, dari mana zoosporangia dibawa oleh angin ke penanaman komersial. Ini dikonfirmasi oleh pengamatan langsung kami di wilayah Moskow, Bryansk, Kostroma, Ryazan: kerusakan tanaman di kebun pribadi diamati bahkan sebelum dimulainya perawatan fungisida untuk penanaman komersial. Selanjutnya, epidemi di ladang besar dikendalikan dengan penggunaan sediaan fungisida, sementara di kebun pribadi berkembang pesat penyakit busuk daun.
Dalam kasus perawatan penanaman komersial yang salah atau "anggaran", fokus penyakit busuk daun muncul di ladang; selanjutnya, mereka secara aktif berkembang, mencakup wilayah yang semakin luas (Elansky, 2015). Infeksi di kebun pribadi memiliki dampak yang signifikan terhadap epidemi di bidang komersial. Di semua wilayah penanaman kentang di Rusia, area yang ditempati kentang di kebun pribadi beberapa kali lebih besar dari total luas ladang produsen besar. Dalam lingkungan seperti itu, kebun sayur pribadi dapat dilihat sebagai sumber daya inokulum global untuk bidang komersial. Mari kita coba mengidentifikasi sifat-sifat yang menjadi ciri genotipe galur di kebun pribadi.
Penanaman benih dan kontrol karantina kentang gudang, benih tomat yang diperoleh dari produsen asing yang meragukan, penanaman kentang dan tomat jangka panjang di area yang sama, perawatan fungisida yang tidak tepat atau ketiadaan sama sekali menyebabkan epifitosis parah di sektor swasta, hasil dari yaitu persilangan bebas, hibridisasi dan pembentukan oospora di kebun pribadi. Akibatnya, keragaman genotipe patogen yang sangat tinggi diamati, ketika hampir setiap strain unik dalam genotipenya (Elansky et al., 2001, 2015). Menanam kentang benih dari berbagai asal genetik membuat galur klonal khusus untuk menyerang varietas tertentu tidak akan muncul. Strain yang dipilih dalam kasus seperti itu dibedakan oleh keserbagunaannya dalam kaitannya dengan varietas yang terkena, kebanyakan dari mereka memiliki jumlah gen virulensi yang mendekati jumlah maksimum. Ini sangat berbeda dari sistem "garis klon" yang khas untuk ladang besar perusahaan pertanian dengan sistem perlindungan yang dipasang dengan benar terhadap penyakit busuk daun. "Garis klon" (ketika semua galur patogen penyakit busuk daun di lapangan diwakili oleh satu atau beberapa genotipe) ada di mana-mana di negara-negara di mana penanaman kentang dilakukan secara eksklusif oleh pertanian besar: Amerika Serikat, Belanda, Denmark, dll. kentang tumbuh, ada juga keragaman genotipe yang lebih tinggi di kebun pribadi. Pada akhir abad ke-20, "garis klon" tersebar luas di bagian Asia dan Timur Jauh Rusia (Elansky et al., 2001), yang tampaknya disebabkan oleh penggunaan varietas yang sama untuk menanam kentang secara eksklusif milik kita sendiri. produksi. Belakangan ini situasi di wilayah tersebut juga mulai berubah menuju peningkatan keragaman genotipe populasi.
Tidak adanya perawatan intensif dengan sediaan fungisida memiliki konsekuensi langsung lainnya - tidak ada akumulasi strain resisten di kebun. Memang, hasil kami menunjukkan bahwa strain tahan metalaksil ditemukan secara signifikan lebih jarang di kebun pribadi daripada di penanaman komersial.
Kedekatan penanaman kentang dan tomat, khas untuk kebun pribadi, memfasilitasi migrasi galur antara tanaman ini, sebagai akibatnya, dalam dekade terakhir, di antara galur yang diisolasi dari kentang, proporsi galur yang membawa gen resistensi untuk varietas tomat ceri (T1), yang sebelumnya hanya berkarakteristik untuk galur " tomat ". Strain dengan gen T1 dalam banyak kasus sangat agresif terhadap kentang dan tomat.
Dalam beberapa tahun terakhir, penyakit busuk daun pada tomat mulai muncul dalam banyak kasus lebih awal daripada kentang. Sumber infeksi bibit tomat dapat berupa oospora di dalam tanah, atau oospora yang ada di dalam biji tomat atau yang menempel di dalamnya (Rubin et al., 2001). Dalam 15 tahun terakhir, sejumlah besar benih kemasan murah, terutama yang diimpor, telah muncul di toko, dan sebagian besar produsen kecil telah beralih menggunakannya. Benih dapat membawa galur dengan genotipe yang khas untuk daerah budidayanya. Di masa depan, genotipe ini termasuk dalam proses seksual di kebun pribadi, yang mengarah pada munculnya genotipe yang sama sekali baru.
Dengan demikian, dapat dikatakan bahwa kebun pribadi adalah "melting pot" global, di mana, sebagai hasil dari pertukaran materi genetik, genotipe yang ada diproses dan yang sama sekali baru muncul. Pada saat yang sama, seleksi mereka terjadi dalam kondisi yang sangat berbeda dari yang dibuat untuk kentang di pertanian besar: tidak adanya pers fungisida, keseragaman penanaman varietas, dominasi tanaman yang dipengaruhi oleh berbagai bentuk infeksi virus dan bakteri, kedekatan terhadap tomat dan nightshades liar, persilangan aktif dan pembentukan oospora, kemungkinan oospora bertindak sebagai sumber infeksi untuk tahun berikutnya.
Semua ini mengarah pada keragaman genotip yang sangat tinggi dari populasi halaman belakang. Dalam kondisi epifitosis di kebun sayur, penyakit busuk daun menyebar dengan sangat cepat dan sejumlah besar spora dilepaskan, terbang ke penanaman komersial terdekat. Namun, setelah memasuki bidang komersial dengan sistem teknologi pertanian dan perlindungan kimia yang benar, spora yang telah terbang secara praktis tidak dapat memulai epifitosis di lapangan, yang disebabkan oleh tidak adanya galur klon yang tahan terhadap fungisida dan terspesialisasi. varietas yang dibudidayakan.
Sumber lain dari inokulum primer mungkin adalah umbi-umbian yang sakit yang terperangkap dalam bibit komersial. Umbi-umbian ini biasanya ditanam di ladang dengan teknologi pertanian yang baik dan perlindungan kimia yang intensif. Genotipe isolat yang mempengaruhi umbi disesuaikan dengan perkembangan varietasnya sendiri. Strain ini secara signifikan lebih berbahaya untuk penanaman komersial daripada inokulum yang berasal dari kebun pribadi. Asumsi ini juga didukung oleh hasil penelitian kami. Populasi yang diisolasi dari lahan luas dengan perlindungan kimia yang dilakukan dengan baik dan teknologi pertanian yang baik tidak berbeda dalam keragaman genotipe yang tinggi. Seringkali ini adalah beberapa garis klon yang sangat agresif.
Strain dari bahan benih komersial dapat memasuki populasi di kebun sayur dan terlibat dalam proses yang terjadi di dalamnya. Namun, di kebun sayur, daya saing mereka akan jauh lebih rendah daripada di bidang komersial, dan segera mereka akan lenyap dalam bentuk garis klonal, tetapi gen mereka dapat digunakan dalam populasi "kebun".
Infeksi yang berkembang pada tanaman "sukarela" dan pada tumpukan umbi yang dimusnahkan selama panen tidak begitu relevan untuk Rusia, karena Di wilayah penanaman kentang utama Rusia, pembekuan tanah musim dingin yang dalam diamati, dan tanaman dari umbi-umbian yang telah melewati musim dingin di tanah jarang berkembang. Selain itu, seperti yang ditunjukkan oleh percobaan kami, patogen penyakit busuk daun tidak bertahan pada suhu negatif bahkan pada umbi yang telah mempertahankan viabilitasnya. Di zona kering, di mana budidaya kentang awal dipraktekkan, penyakit busuk daun cukup langka karena musim tanam yang kering dan panas.
Dengan demikian, kami sedang mengamati pembagian populasi P. infestans menjadi populasi “lapangan” dan “kebun”. Namun, dalam beberapa tahun terakhir, proses telah diamati yang mengarah pada konvergensi dan interpenetrasi genotipe dari populasi ini.
Di antara mereka, dapat dicatat peningkatan umum dalam literasi produsen kecil, munculnya paket kecil benih kentang yang terjangkau, penyebaran sediaan fungisida dalam kemasan kecil, dan hilangnya rasa takut "kimiawi" oleh penduduk.
Situasi muncul ketika, berkat aktivitas kuat dari satu pemasok, seluruh desa ditanami umbi benih dari varietas yang sama dan diberikan paket kecil pestisida yang sama. Dapat diasumsikan bahwa kentang dari varietas yang sama akan ditemukan pada penanaman komersial di dekatnya.
Di sisi lain, beberapa perusahaan perdagangan pestisida mempromosikan skema perawatan kimia "anggaran". Dalam hal ini, jumlah perawatan yang direkomendasikan diremehkan dan fungisida termurah ditawarkan, dan penekanannya bukan pada pencegahan perkembangan penyakit busuk daun hingga pemotongan pucuk, tetapi pada penundaan tertentu dalam epifit untuk meningkatkan hasil. Skema semacam itu dibenarkan secara ekonomi ketika menanam kentang dari bahan benih bermutu rendah, ketika pada prinsipnya tidak ada pertanyaan untuk mendapatkan hasil tinggi. Namun, dalam kasus ini, berbeda dengan populasi kebun, latar belakang genetik kentang yang merata berkontribusi pada pemilihan ras fisiologis tertentu, yang sangat berbahaya untuk varietas ini.
Secara umum, kecenderungan ke arah konvergensi metode produksi kentang "kebun" dan "ladang" tampaknya agak berbahaya bagi kami. Untuk mencegah konsekuensi negatifnya, baik di rumah tangga maupun di sektor komersial, akan diperlukan baik untuk mengontrol bermacam-macam kentang benih dan kisaran fungisida yang ditawarkan kepada pemilik swasta dalam kemasan kecil, dan untuk melacak skema perlindungan kentang dan penggunaannya. sediaan fungisida di sektor komersial.
Di wilayah sektor swasta, tidak hanya terjadi pengembangan penyakit busuk daun secara intensif, tetapi juga Alternaria. Sebagian besar pemilik plot rumah tangga pribadi tidak mengambil tindakan khusus untuk melindungi dari Alternaria, salah mengira pengembangan Alternaria sebagai daun yang layu alami atau perkembangan penyakit busuk daun. Oleh karena itu, dengan masifnya pengembangan Alternaria pada varietas rentan, petak rumah tangga dapat menjadi sumber inokulum untuk penanaman komersial.
Mekanisme variabilitas
Proses mutasi
Karena terjadinya mutasi merupakan proses acak yang berlangsung dengan frekuensi rendah, maka terjadinya mutasi pada setiap lokus bergantung pada frekuensi mutasi lokus tersebut dan ukuran populasi. Ketika mempelajari frekuensi mutasi strain P. infestans, biasanya ditentukan jumlah koloni yang tumbuh pada media nutrisi selektif setelah perlakuan dengan mutagen kimia atau fisik. Seperti dapat dilihat dari data yang disajikan pada Tabel 8, frekuensi mutasi dari strain yang sama pada lokus yang berbeda dapat berbeda beberapa kali lipat. Frekuensi mutasi yang tinggi dalam resistensi terhadap metalaksil mungkin menjadi salah satu alasan akumulasi strain yang resisten terhadapnya di alam.
Frekuensi mutasi spontan atau yang diinduksi, dihitung berdasarkan percobaan laboratorium, tidak selalu sesuai dengan proses yang terjadi pada populasi alami, karena alasan berikut:
1. Dalam fisi nuklir asinkron, tidak mungkin untuk memperkirakan frekuensi mutasi per satu generasi nuklir. Oleh karena itu, sebagian besar eksperimen hanya memberikan informasi secara langsung tentang frekuensi mutasi, tanpa membedakan antara dua peristiwa mutasi dan satu peristiwa setelah mitosis.
2. Mutasi satu langkah biasanya mengurangi keseimbangan genom, oleh karena itu, seiring dengan perolehan properti baru, kebugaran keseluruhan organisme menurun. Sebagian besar mutasi yang diperoleh secara eksperimental memiliki agresivitas yang berkurang dan tidak dicatat dalam populasi alami. Dengan demikian, koefisien korelasi antara derajat ketahanan mutan P. infestans terhadap fungisida fenilamid dan laju pertumbuhan pada lingkungan buatan rata-rata (-0,62), dan ketahanan terhadap fungisida dan agresivitas pada daun kentang (-0,65) (Derevyagina). et al., 1993), yang menunjukkan rendahnya kebugaran mutan. Mutasi resistensi terhadap dimethomorph juga disertai dengan penurunan tajam dalam viabilitas (Bagirova et al., 2001).
3. Sebagian besar mutasi spontan dan terinduksi bersifat resesif dan tidak menampakkan diri secara fenotipik dalam eksperimen, tetapi mereka merupakan cadangan variabilitas tersembunyi dalam populasi alami. Strain mutan yang diisolasi dalam percobaan laboratorium membawa mutasi dominan atau semi-dominan (Kulish dan Dyakov, 1979). Rupanya, diploidi nuklir menjelaskan upaya yang gagal untuk mendapatkan mutan di bawah pengaruh iradiasi UV yang virulen pada varietas yang sebelumnya tahan (McKee, 1969). Menurut perhitungan penulis, mutasi semacam itu dapat terjadi dengan frekuensi kurang dari 1: 500000. Transisi mutasi resesif ke homozigot, keadaan fenotip dapat terjadi karena rekombinasi seksual atau aseksual (lihat di bawah). Namun, bahkan dalam kasus ini, mutasi dapat ditutupi oleh alel dominan dari nukleus tipe liar dalam miselium cenotik (berinti banyak) dan secara fenotip difiksasi hanya selama pembentukan zoospora mononuklear.
Tabel 8. Frekuensi mutasi P. infestans menjadi zat penghambat pertumbuhan di bawah aksi nitrosomethylurea (Dolgova, Dyakov, 1986; Bagirova et al., 2001)
Koneksi | Frekuensi mutasi |
Oksitetrasiklin | 6,9 10 x-8 |
Blastidin S | X 7,2 10-8 |
Streptomisin | 8,3 x10-8 |
Trichothecin | 1,8 10 x-8 |
Sikloheksimid | 2,1 10 x-8 |
daaconil | <4 x 10-8 |
dimetomorf | 6,3 10 x-7 |
Metalaksil | 6,9 10 x-6 |
Ukuran populasi juga memainkan peran yang menentukan dalam munculnya mutasi spontan. Dalam populasi yang sangat besar, di mana jumlah sel N> 1 / a, di mana a adalah laju mutasi, mutasi tidak lagi menjadi fenomena acak (Kvitko, 1974).
Perhitungan menunjukkan bahwa dengan serangan rata-rata pada lahan kentang (35 titik pada satu tanaman), 8x1012 spora terbentuk setiap hari pada satu hektar (Dyakov dan Suprun, 1984). Rupanya, populasi seperti itu mengandung semua mutasi yang diizinkan oleh jenis pertukaran di setiap lokus. Bahkan mutasi langka, yang terjadi dengan frekuensi 10-9, akan diperoleh oleh seribu individu dari jutaan yang hidup di satu hektar ladang kentang. Untuk mutasi yang terjadi dengan frekuensi yang lebih tinggi (misalnya, 10-6), dalam populasi seperti itu, berbagai mutasi berpasangan dapat terjadi setiap hari (bersamaan di dua lokus), mis. proses mutasi akan menggantikan rekombinasi.
Migrasi
Untuk P. infestans, dua jenis utama migrasi diketahui: jarak dekat (dalam ladang kentang atau ladang tetangga) dengan menyebarkan zoosporangia melalui aliran udara atau semprotan hujan, dan jarak jauh - dengan menanam umbi atau buah tomat yang diangkut. Metode pertama memastikan perluasan fokus penyakit, yang kedua - penciptaan fokus baru di tempat-tempat yang jauh dari yang utama.
Penyebaran infeksi pada umbi dan buah tomat tidak hanya berkontribusi pada munculnya penyakit di tempat baru, tetapi juga merupakan sumber utama keragaman genetik dalam populasi. Di wilayah Moskow, kentang ditanam, dibawa dari berbagai daerah di Rusia dan Eropa Barat. Buah tomat dibawa dari wilayah selatan Rusia (Wilayah Astrakhan, Wilayah Krasnodar, Kaukasus Utara). Bibit tomat yang juga dapat menjadi sumber infeksi (Rubin et al., 2001), juga didatangkan dari wilayah selatan Rusia, Cina, negara-negara Eropa dan negara-negara lain.
Menurut perhitungan E. Mayr (1974), perubahan genetik pada populasi lokal yang disebabkan oleh mutasi jarang melebihi 10-5 per lokus, sedangkan pada populasi terbuka, pertukaran karena aliran balik gen setidaknya 10-3 - 10-4.
Migrasi pada umbi yang terinfeksi bertanggung jawab atas masuknya P. infestans ke Eropa, menyebar ke seluruh wilayah di dunia tempat kentang ditanam; mereka menyebabkan perubahan populasi yang paling serius. Penyakit busuk daun pada kentang muncul di wilayah Kekaisaran Rusia hampir bersamaan dengan kemunculannya di Eropa Barat.
Sejak penyakit ini pertama kali dicatat pada tahun 1846-1847 di Negara-negara Baltik dan hanya pada tahun-tahun berikutnya menyebar di Belarus dan wilayah barat laut Rusia, asal Eropa Baratnya jelas. Sumber pertama penyakit busuk daun di Dunia Lama tidak begitu jelas. Hipotesis yang dikembangkan oleh Fry et al. (Fry et al., 1992; Fry, Goodwin, 1995, Goodwin et al., 1994) menunjukkan bahwa parasit pertama kali datang dari Meksiko ke Amerika Utara, di mana ia menyebar ke tanaman, dan kemudian diangkut ke Eropa Barat (gbr. 7).
Sebagai hasil dari penyimpangan berulang (efek ganda dari "kemacetan"), klon tunggal sampai ke Eropa, yang keturunannya menyebabkan pandemi di seluruh wilayah Dunia Lama, tempat kentang ditanam. Sebagai bukti hipotesis ini, penulis mengutip, pertama, hanya satu jenis perkawinan (A1) yang terjadi di mana-mana dan, kedua, homogenitas genotipe galur yang diteliti dari berbagai daerah (semuanya didasarkan pada penanda molekuler, termasuk 2 lokus isozim, pola sidik jari DNA, dan struktur DNA mitokondria identik dan sesuai dengan klon US-1 yang dijelaskan di AS). Namun, beberapa data menimbulkan keraguan tentang setidaknya beberapa ketentuan hipotesis yang dinyatakan. Analisis DNA mitokondria P. infestans yang diisolasi dari sampel kentang herbarium yang terinfeksi selama periode epifitosis pertama tahun 40-an menunjukkan bahwa mereka berbeda dalam struktur DNA mitokondria dari klon US-1, yang, oleh karena itu, setidaknya bukan satu-satunya sumber infeksi. di Eropa (Ristaino et al, 2001).
Situasi dengan penyakit busuk daun kembali memburuk pada tahun 80-an abad XX. Perubahan berikut telah terjadi:
1) Agresivitas rata-rata populasi telah meningkat, yang telah menyebabkan, khususnya, penyebaran luas bentuk penyakit busuk daun yang paling berbahaya - kerusakan pada tangkai daun dan batang.
2) Ada pergeseran waktu munculnya penyakit busuk daun pada kentang - dari akhir Juli hingga awal Juli dan bahkan hingga akhir Juni.
3) Jenis kawin A2, yang sebelumnya tidak ada di Dunia Lama, telah ada di mana-mana.
Perubahan tersebut didahului oleh dua peristiwa: penggunaan besar-besaran fungisida metalaksil baru (Schwinn dan Staub, 1980) dan munculnya Meksiko sebagai pengekspor kentang dunia (Niederhauser, 1993). Sesuai dengan ini, dua alasan untuk perubahan populasi dikemukakan - konversi tipe kawin di bawah pengaruh metalaksil (Ko, 1994) dan pengenalan galur baru secara besar-besaran dengan umbi yang terinfeksi dari Meksiko (Fry dan Goodwin, 1995). Meskipun interkonversi jenis kawin di bawah pengaruh metalaksil diperoleh tidak hanya oleh Ko, tetapi juga dalam pekerjaan yang dilakukan di laboratorium Universitas Negeri Moskow (Savenkova, Chherepennicova-Anikina, 2002), hipotesis kedua lebih disukai. Seiring dengan munculnya jenis kawin kedua, perubahan serius terjadi pada genotipe galur P. infestans Rusia, termasuk pada gen netral (isozim dan lokus RFLP), serta pada struktur DNA mitokondria. Kompleksitas perubahan ini tidak dapat dijelaskan oleh aksi metalaksil; melainkan, ada impor besar-besaran galur baru dari Meksiko, yang menjadi lebih agresif (Kato et al., 1997), menggantikan galur lama (US-1) , menjadi dominan dalam populasi. Perubahan komposisi populasi Eropa terjadi dalam waktu yang sangat singkat - dari tahun 1980 hingga 1985 (Fry et al., 1992). Di wilayah bekas Uni Soviet, "strain baru" ditemukan dalam koleksi dari Estonia pada tahun 1985, yaitu, lebih awal daripada di Polandia dan Jerman (Goodwin et al., 1994). Terakhir kali "strain lama US-1" di Rusia diisolasi dari tomat yang terinfeksi di wilayah Moskow pada tahun 1993 (Dolgova et al., 1997). Juga di Prancis, galur “tua” ditemukan pada pertanaman tomat sampai awal tahun 90-an, yaitu setelah lama menghilang pada kentang (Leberton dan Andrivon, 1998). Perubahan strain P. infestans mempengaruhi banyak sifat, termasuk yang sangat penting secara praktis, dan meningkatkan keparahan penyakit busuk daun.
Rekombinasi seksual
Agar rekombinasi seksual berkontribusi pada variabilitas, perlu, pertama, adanya dua jenis perkawinan dalam populasi dalam rasio yang mendekati 1: 1, dan, kedua, adanya variabilitas populasi awal.
Rasio jenis kawin sangat bervariasi pada populasi yang berbeda dan bahkan pada tahun yang berbeda pada populasi yang sama (Tabel 9,10, 90). Alasan untuk perubahan drastis dalam frekuensi jenis kawin dalam populasi (seperti, misalnya, di Rusia atau Israel pada awal 2002-an abad terakhir) tidak diketahui, tetapi diyakini bahwa ini disebabkan oleh pengenalan yang lebih kompetitif. klon (Cohen, XNUMX).
Beberapa data tidak langsung menunjukkan jalannya proses seksual pada tahun-tahun tertentu dan di wilayah tertentu:
1) Studi populasi dari wilayah Moskow menunjukkan bahwa dalam 13 populasi di mana pangsa tipe kawin A2 kurang dari 10%, keragaman genetik total, dihitung untuk tiga lokus isozim, adalah 0,08, dan pada 14 populasi di mana pangsa A2 melebihi 30%, keragaman genetik dua kali lebih tinggi (0,15) (Elansky et al., 1999). Dengan demikian, semakin tinggi kemungkinan hubungan seksual, semakin besar keragaman genetik populasi.
2) Hubungan antara rasio jenis kawin dalam populasi dan intensitas pembentukan oospora diamati di Israel (Cohen et al., 1997) dan di Belanda
(Flier et al., 2004). Studi kami telah menunjukkan bahwa pada populasi di mana isolat dengan tipe kawin A2 menyumbang 62, 17, 9, dan 6%, oospora ditemukan di 78, 50, 30, dan 15% dari daun kentang yang dianalisis (memiliki 2 atau lebih daun kentang). bintik), masing-masing.
Sampel dengan 2 bercak atau lebih secara signifikan lebih sering mengandung oospora daripada sampel dengan 1 bercak (masing-masing 32 dan 14% sampel) (Apryshko et al., 2004).
Oospora jauh lebih umum pada daun lapisan tengah dan bawah tanaman kentang (Mytsa et al., 2015; Elansky et al., 2016).
3) Di beberapa daerah, genotipe unik telah ditemukan, yang kemunculannya dikaitkan dengan rekombinasi seksual. Jadi, di Polandia pada tahun 1989 dan di Perancis pada tahun 1990, strain homozigot untuk glukosa-6-
fosfat isomerase (GPI 90/90). Karena sebelumnya hanya 10/90 heterozigot yang ditemukan selama 100 tahun, homozigositas dikaitkan dengan rekombinasi seksual (Sujkowski et al., 1994). Di Kolombia (AS), isolat yang menggabungkan A2 dengan GPI 100/110 dan A1 dengan GPI 100/100 adalah umum; namun, pada akhir musim 1994 (16 Agustus dan 9 September), galur dengan genotipe rekombinan (A1 GPI 100/ 110 dan A2 GPI 100/100) (Miller et al., 1997).
4) Pada beberapa populasi dari Polandia (Sujkowski et al., 1994) dan Kaukasus Utara (Amatkhanova et al., 2004), distribusi lokus DNA sidik jari dan lokus protein allozim sesuai dengan distribusi Hardy-Weinberg, yang menunjukkan
tentang bagian yang tinggi dari kontribusi rekombinasi seksual terhadap variabilitas populasi. Di wilayah lain di Rusia, tidak ada korespondensi dengan distribusi Hardy-Weinberg dalam populasi yang ditemukan, tetapi kehadiran ketidakseimbangan hubungan ditunjukkan, menunjukkan dominasi reproduksi klon (Elansky et al., 1999).
5) Keragaman genetik (GST) antar galur dengan tipe perkawinan berbeda (A1 dan A2) lebih rendah dibandingkan antar populasi yang berbeda (Sujkowski et al., 1994), yang secara tidak langsung mengindikasikan persilangan seksual.
Pada saat yang sama, kontribusi rekombinasi seksual terhadap keragaman populasi tidak bisa terlalu tinggi. Kontribusi ini dihitung untuk populasi wilayah Moskow (Elansky et al., 1999). Menurut perhitungan Lewontin (1979) "rekombinasi, yang dapat menghasilkan varian baru dari dua lokus dengan frekuensi tidak melebihi produk heterozigositasnya, menjadi efektif hanya jika nilai heterozigositas untuk kedua alel sudah tinggi."
Dengan rasio dua jenis pasangan, yang khas untuk wilayah Moskow, sama dengan 4: 1, frekuensi rekombinasi akan menjadi 0,25. Probabilitas bahwa galur yang disilangkan akan menjadi heterozigot untuk dua dari tiga lokus isozim yang dipelajari dalam populasi yang diteliti adalah 0,01 (2 galur dari 177). Oleh karena itu, peluang terjadinya heterozigot ganda sebagai hasil rekombinasi tidak boleh melebihi produknya dikalikan dengan peluang persilangan (0,25x0,02x0,02) = 10-4, mis. rekombinan seksual biasanya tidak termasuk dalam sampel galur yang diteliti. Perhitungan ini dibuat untuk populasi dari wilayah Moskow, yang dicirikan oleh variabilitas yang relatif tinggi. Dalam populasi monomorfik seperti yang Siberia, proses seksual, bahkan jika itu terjadi pada populasi individu, tidak dapat mempengaruhi keragaman genetik mereka.
Selain itu, P. infestans ditandai dengan seringnya ketidaksejajaran kromosom pada meiosis, yang menyebabkan aneuploidi (Carter et al., 1999). Gangguan tersebut mengurangi kesuburan hibrida.
Rekombinasi paraseksual, konversi gen mitosis
Dalam percobaan penyambungan galur P. infestans dengan mutasi resistensi terhadap penghambat pertumbuhan yang berbeda, ditemukan munculnya misolat yang resisten terhadap kedua penghambat tersebut (Shattock dan Shaw, 1975; Dyakov, Kuzovnikova, 1974; Kulish, Dyakov,
1979). Strain yang resisten terhadap dua penghambat pertumbuhan muncul sebagai akibat dari heterokariotisasi miselium, dan dalam hal ini, mereka membelah selama reproduksi oleh zoospora mononuklear (Judelson, Ge Yang, 1998), atau tidak membelah pada keturunan monozoosporus, karena mereka memiliki tetraploid ( karena isolat awal adalah inti diploid (K , 1979). Diploid heterozigot dipisahkan pada frekuensi yang sangat rendah karena haploidisasi, nondisjungsi kromosom, dan persilangan mitosis (Poedinok et al., 1982). Frekuensi proses ini dapat ditingkatkan dengan bantuan efek tertentu pada diploid heterozigot (misalnya, penyinaran UV dari spora yang berkecambah).
Meskipun pembentukan hibrida vegetatif dengan resistensi ganda terjadi tidak hanya secara in vitro, tetapi juga pada umbi kentang yang terinfeksi dengan campuran mutan (Kulish et al., 1978), agak sulit untuk menilai peran rekombinasi paraseksual dalam generasi genotipe baru dalam populasi. Frekuensi pembentukan segregan karena haploidisasi, nondisjungsi kromosom dan persilangan mitosis tanpa efek khusus dapat diabaikan (kurang dari 10-3).
Munculnya segregan homozigot dari strain heterozigot dapat didasarkan pada persilangan mitosis dan konversi gen mitosis, yang pada P. sojae terjadi dengan frekuensi 3 x 10-2 hingga 5 x 10-5 per lokus, tergantung pada strain ( Chamnanpunt dkk., 2001).
Meskipun frekuensi kemunculan heterokaryon dan diploid heterozigot ternyata sangat tinggi (mencapai puluhan persen), proses ini hanya terjadi jika kultur mutan yang diperoleh dari galur yang sama disambung. Ketika menggunakan galur yang berbeda yang diisolasi dari alam, heterokariotisasi tidak terjadi (atau terjadi dengan frekuensi yang sangat rendah) karena adanya ketidakcocokan vegetatif (Poedinok dan Dyakov, 1981; Anikina et al., 1997b; Cherepennikova-Anikina et al., 2002 ). Akibatnya, peran rekombinasi paraseksual hanya dapat direduksi menjadi rekombinasi intraklonal dalam inti heterozigot dan transisi gen individu ke keadaan homozigot tanpa proses seksual. Proses ini dapat menjadi signifikan secara epidemiologis pada strain dengan mutasi resistensi fungisida resesif atau semi-dominan. Transisinya ke keadaan homozigot karena proses paraseksual akan meningkatkan resistensi pembawa mutasi (Dolgova, Dyakov, 1986).
Introgresi gen
Spesies heterotalik Phytophthora mampu kawin silang untuk membentuk oospora hibrida (lihat Vorob'eva dan Gridnev, 1983; Sansome et al., 1991; Veld et al., 1998). Hibrida alami dari dua spesies Phytophthora begitu agresif sehingga membunuh ribuan alder di Inggris (Brasier et al., 1999). P. infestans dapat terjadi dengan spesies lain dari genus (P. erythroseptica, P. nicotianae, P. Cactorum, dll.) pada tanaman inang umum dan di tanah, tetapi ada sedikit informasi dalam literatur tentang kemungkinan hibrida interspesifik . Di bawah kondisi laboratorium, hibrida diperoleh antara P. infestans dan P. Mirabilis (Goodwin dan Fry, 1994).
Tabel 9. Proporsi galur P. infestans dengan tipe kawin A2 di berbagai negara di dunia pada periode 1990-2000 (menurut data sumber dan situs open literature www.euroblight.net, www.eucablight.org)
Negara | 1990 | 1991 | 1992 | 1993 | 1994 | 1995 | 1996 | 1997 | 1998 | 1999 | 2000 |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Belarus | 33 (12) | 34 (29) | |||||||||
Belgia | 15 (49 *) | 6 (66) | 20 (86) | ||||||||
Ekuador | 0 (13) | 0 (12) | 0 (19) | 0 (21) | 12 (41) | 25 (39) | 15 (75) | 22 (73) | 25 (68) | 0 (35) | |
Estonia | 8 (12) | ||||||||||
Inggris | 4 (26) | 3 (630) | 9 (336) | ||||||||
Finlandia | 0 (15) | 19 (117) | 12 (16) | 21 (447) | 6 (509) | 9 (432) | 43 (550) | ||||
Perancis | 0 (35) | 0 (56) | 0 (83) | 0 (67) | 0 (86) | 2 (135) | 7 (156) | 6 (123) | 0 (73) | 0 (285) | 0 (135) |
Hongaria | 72 (32) | ||||||||||
Irlandia | 4 (145) | ||||||||||
Utara. Irlandia | 10 (41) | 9 (58) | 1 (106) | 0 (185) | 0 (18) | 0 (56) | 0 (35) | 0 (26) | |||
Belanda | 7 (41) | 5 (276) | 24 (377) | 44 (353) | 23 (185) | ||||||
Norwegia | 25 (446) | 28 (156) | 8 (39) | 18 (257) | 38 (197) | ||||||
Peru | 0 (34, 1984 -86) | 0 (287, 1997-98) | 0 (112) | 0 (66) | |||||||
Polandia | 19 (180) | 21 (142) | 33 (256) | 26 (149) | 35 (70) | ||||||
Skotlandia | 25 (147) | 11 (163) | 22 (189) | 5 (22) | |||||||
Swedia | 25 (263) | 62 (258) | 49 (163) | ||||||||
Wales | 0 (16) | 7 (97) | 0 (48) | 0 (25) | |||||||
Korea | 36 (42) | 10 (130) | 15 (98) | ||||||||
Cina | 20 (142, 1995-98) | 0 (6) | 0 (8) | 0 (35) | |||||||
Kolumbia | 0 (40, 1994-2000) | ||||||||||
Uruguay | 100 (25, 1998-99) | ||||||||||
Maroko | 60 (108, 1997-2000) | 52 (25) | 42 (40) | ||||||||
Сербия | 76 (37) | ||||||||||
Mexico (Toluca) | 28 (292, 1988-89) | 50 (389, 1997-98) |
Tabel 10. Proporsi galur P. infestans dengan tipe kawin A2 di berbagai negara di dunia pada periode 2000-2011
Negara | 2001 | 2002 | 2003 | 2004 | 2005 | 2006 | 2007 | 2008 | 2009 | 2010 | 2011 |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Austria | 65 (83) | ||||||||||
Belarus | 42 (78) | ||||||||||
Belgia | 20 (102 *) | 4 (32) | 50 (14) | 25 (16) | 62 (13) | 54 (26) | 70 (54) | 30 (23) | 29 (35) | 62 (71) | 45 (49) |
Swiss | 89 (19) | ||||||||||
Чехия | 35 (31) | 54 (64) | 38 (174) | 12 (80) | |||||||
Jerman | 95 (53) | ||||||||||
Denmark | 48 (52) | ||||||||||
Ekuador | 5 (178) | 6 (108) | 9 (121) | 18 (94) | 2 (44) | 0 (66) | 5 (47) | ||||
Estonia | 54 (25) | 0 (24) | 33 (62) | 45 (140) | 25 (100) | 12 (103) | |||||
Inggris | 4 (47) | 10 (96) | 31 (55) | 55 (790) | 68 (862) | 70 (552) | 68 (299) | ||||
Finlandia | 47 (162) | 12 (218) | 42 | ||||||||
Perancis | 0 (186) | 4 (108) | 8 (61) | 22 (103) | 33 (303) | 65 (378) | 74 (331) | 75 (125) | 75 (12) | ||
Hongaria | 48 (27) | 48 (90) | 9 | 7 | |||||||
Utara. Irlandia | 0 (38) | 0 (58) | 0 (40) | 0 (24) | 5 (54) | 0 (18) | 27 (578) | 45 (239) | 36 (213) | 82 (60) | 10 (80) |
Belanda | 66 (24) | 93 (15) | 91 (11) | ||||||||
Norwegia | 39 (328) | 3 (115) | 12 (19) | ||||||||
Peru | 0 (36) | ||||||||||
Polandia | 25 (46) | 10 (30) | 85 (20) | 38 (44) | 75 (66) | 55 (56) | 65 (35) | 72 (81) | 85 (21) | ||
Skotlandia | 3 (213) | 2 (474) | 24 (135) | 86 (337) | 88 (386) | 74 (172) | |||||
Swedia | 60 (277) | 39 (87) | |||||||||
Slovakia | 0 (36) | 14 (26) | 62 (26) | 0 (26) | |||||||
Wales | 25 (12) | 68 (106) | 80 (88) | 92 (143) | 75 (45) | ||||||
Korea | 46 (26) | ||||||||||
Brazil | 0 (49) | 0 (30) | |||||||||
Cina | 10 (30) | 0 (6) | 0 (6) | ||||||||
Vietnam | 0 (294, 2003-04) | ||||||||||
Uganda | 0 (8) |
Dinamika komposisi genotip populasi
Perubahan komposisi genotipe populasi P. infestans dapat terjadi di bawah pengaruh migrasi klon baru dari daerah lain, praktik pertanian (perubahan varietas, aplikasi fungisida) dan kondisi cuaca. Pengaruh eksternal mempengaruhi klon yang berbeda pada tahap yang berbeda dari siklus hidup; oleh karena itu, populasi setiap tahun mengalami perubahan siklus dalam frekuensi gen yang tunduk pada seleksi, karena perubahan peran dominan pergeseran dan seleksi gen.
Pengaruh varietas
Varietas baru dengan gen yang efektif untuk ketahanan vertikal (R-gen) merupakan faktor selektif yang kuat yang menyeleksi klon dengan gen virulensi komplementer pada populasi P. infestans. Dengan tidak adanya resistensi nonspesifik pada varietas kentang, yang menghambat pertumbuhan populasi patogen, proses penggantian klon dominan dalam populasi terjadi sangat cepat. Jadi, setelah penyebaran varietas Domodedovsky di wilayah Moskow yang memiliki gen ketahanan R3, frekuensi klon virulen untuk varietas ini meningkat dari 0,2 menjadi 0,82 dalam satu tahun (Dyakov, Derevjagina, 2000).
Namun, perubahan frekuensi gen virulensi (patotipe) dalam populasi terjadi tidak hanya di bawah pengaruh varietas kentang yang dibudidayakan. Sebagai contoh, di Belarus sampai tahun 1977 mendominasi klon dengan gen virulensi 1 dan 4 yang disebabkan oleh budidaya varietas kentang dengan gen ketahanan R1 dan R4 (Dorozhkin dan Belskaya, 1979). Namun, pada akhir tahun 70-an abad XX, klon muncul dengan gen virulensi yang berbeda dan kombinasinya, dan gen resistensi komplementer tidak pernah digunakan dalam pemuliaan kentang (gen virulensi ekstra) (Ivanyuk et al., 2002). Alasan munculnya klon semacam itu, tampaknya, adalah karena migrasi bahan infeksius dari Meksiko ke Eropa dengan umbi kentang. Di rumah, klon-klon ini berkembang tidak hanya pada kentang budidaya, tetapi juga pada spesies liar yang membawa berbagai gen resistensi; oleh karena itu, kombinasi banyak gen virulensi dalam genom diperlukan untuk bertahan hidup dalam kondisi tersebut.
Adapun varietas dengan resistensi nonspesifik, mereka, dengan mengurangi laju reproduksi patogen, menunda evolusi populasinya, yang, sebagaimana telah disebutkan, merupakan fungsi jumlah. Karena agresivitas bersifat poligenik, klon yang mengandung lebih banyak gen untuk "agresivitas" terakumulasi semakin cepat, semakin tinggi ukuran populasi. Oleh karena itu, ras yang sangat agresif bukanlah produk adaptasi terhadap varietas yang dibudidayakan dengan ketahanan nonspesifik, tetapi, sebaliknya, lebih mungkin dideteksi pada penanaman varietas yang sangat rentan yang merupakan akumulator spora parasit.
Jadi, di Rusia, populasi P. Infestans yang paling agresif ditemukan di zona epifitoti tahunan (populasi dari wilayah Sakhalin, Leningrad, dan Bryansk). Agresivitas populasi ini ternyata lebih tinggi daripada populasi Meksiko (Filippov et al., 2004).
Selain itu, lebih sedikit oospora yang terbentuk pada daun varietas tahan dibandingkan pada daun yang rentan (Hanson dan Shattock, 1998), yaitu, resistensi nonspesifik dari varietas tersebut juga mengurangi kemampuan rekombinasi parasit dan kemungkinan metode alternatif musim dingin.
Pengaruh fungisida
Fungisida tidak hanya mengurangi jumlah jamur fitopatogen, yaitu mempengaruhi karakteristik kuantitatif populasi mereka, tetapi juga dapat mengubah frekuensi genotipe individu, mis. mempengaruhi komposisi kualitatif populasi. Di antara indikator paling penting dari populasi yang berubah di bawah pengaruh fungisida adalah sebagai berikut: perubahan resistensi terhadap fungisida, perubahan agresivitas dan virulensi, dan perubahan sistem reproduksi.
Pengaruh fungisida terhadap resistensi dan agresivitas populasi
Tingkat efek ini ditentukan, pertama-tama, oleh jenis fungisida yang digunakan, yang secara kondisional dapat dibagi menjadi polysite, oligosite dan monosite.
Yang pertama mencakup sebagian besar fungisida kontak. Perlawanan terhadap mereka (jika mungkin sama sekali) dikendalikan oleh sejumlah besar gen ekspresif yang sangat lemah. Sifat-sifat ini menentukan tidak adanya perubahan yang terlihat dalam resistensi populasi setelah perlakuannya dengan fungisida (walaupun dalam beberapa percobaan diperoleh beberapa peningkatan resistensi). Populasi jamur yang diawetkan setelah disemprot dengan fungisida kontak terdiri dari dua kelompok galur:
1) Strain yang diawetkan di area tanaman yang tidak diobati dengan obat. Karena tidak ada kontak dengan fungisida, agresivitas dan resistensi strain ini tidak berubah.
2) Strain yang kontak dengan fungisida, yang konsentrasinya pada titik kontak di bawah letal. Seperti disebutkan di atas, resistensi bagian populasi ini juga tidak berubah, namun, karena efek kerusakan parsial fungisida bahkan dalam konsentrasi subletal pada metabolisme sel jamur, kebugaran umum dan komponen parasitnya, agresivitas, menurun (Derevyagina dan Dyakov, 1990).
Dengan demikian, bahkan sebagian dari populasi yang tidak mati, terkena kontak dengan fungisida, memiliki agresivitas yang lemah dan tidak dapat menjadi sumber epifitosis. Oleh karena itu, pengolahan yang hati-hati, yang mengurangi frekuensi proporsi populasi yang tidak kontak dengan fungisida, merupakan syarat keberhasilan tindakan perlindungan. Resistensi terhadap fungisida oligosite dikendalikan oleh beberapa gen aditif.
Mutasi setiap gen menyebabkan beberapa peningkatan resistensi, dan tingkat resistensi secara keseluruhan disebabkan oleh penambahan mutasi tersebut. Oleh karena itu, peningkatan resistensi terjadi secara bertahap. Contoh peningkatan resistensi bertahap adalah mutasi resistensi terhadap dimetomorf fungisida, yang banyak digunakan untuk melindungi kentang dari penyakit busuk daun. Resistensi dimethomorph bersifat poligenik dan aditif. Mutasi satu langkah sedikit meningkatkan resistensi.
Setiap mutasi berikutnya menurunkan ukuran target dan, akibatnya, frekuensi mutasi berikutnya (Bagirova et al., 2001). Peningkatan rata-rata resistensi populasi setelah beberapa kali perlakuan dengan fungisida oligosit terjadi secara bertahap dan bertahap. Laju proses ini ditentukan oleh setidaknya tiga faktor: frekuensi mutasi gen resistensi, koefisien resistensi (rasio dosis mematikan strain resisten dalam kaitannya dengan yang sensitif), dan efek mutasi pada gen resistensi pada kebugaran.
Frekuensi terjadinya setiap mutasi berikutnya lebih rendah dari mutasi sebelumnya, sehingga proses tersebut bersifat redaman (Bagirova et al., 2001). Namun, jika proses rekombinasi (seksual atau paraseksual) terjadi dalam populasi, maka dimungkinkan untuk menggabungkan mutasi yang berbeda dari orang tua dalam galur hibrida dan mempercepat prosesnya. Oleh karena itu, populasi panmix memperoleh resistensi lebih cepat daripada yang agamis, dan yang terakhir, populasi yang tidak memiliki hambatan ketidakcocokan vegetatif lebih cepat daripada populasi yang dipisahkan oleh hambatan tersebut. Dalam hal ini, kehadiran galur dalam populasi yang berbeda dalam jenis kawin mempercepat proses memperoleh resistensi terhadap fungisida oligosit.
Faktor kedua dan ketiga tidak berkontribusi pada akumulasi cepat strain resisten dimetomorf dalam populasi. Setiap mutasi berikutnya kira-kira menggandakan resistensi, yang tidak signifikan, dan pada saat yang sama mengurangi tingkat pertumbuhan dalam lingkungan buatan dan agresivitas (Bagirova et al., 2001; Stem, Kirk, 2004). Mungkin, oleh karena itu, di antara galur alami P. infestans, bahkan galur yang dikumpulkan dari pertanaman kentang yang diberi perlakuan dimetomorf, praktis tidak ada galur yang tahan.
Suatu populasi yang diberi fungisida oligosit juga akan terdiri dari dua kelompok galur: galur yang belum kontak dengan fungisida, dan karena itu tidak mengubah sifat awal (jika galur resisten ditemukan di antara kelompok ini, galur tersebut tidak akan terakumulasi karena untuk agresivitas dan daya saing yang lebih tinggi dari galur sensitif), dan galur yang kontak dengan konsentrasi fungisida yang tidak mematikan. Di antara yang terakhir inilah akumulasi strain resisten dimungkinkan, karena di sini mereka memiliki keunggulan dibandingkan yang sensitif.
Oleh karena itu, ketika menggunakan fungisida oligosit, pemrosesan yang tidak terlalu hati-hati yang penting karena konsentrasi obat yang tinggi, beberapa kali lebih tinggi dari dosis yang mematikan, karena dengan mutagenesis bertahap, resistensi awal dari galur bermutasi rendah.
Akhirnya, mutasi pada resistensi terhadap fungisida monosit sangat ekspresif, yaitu, satu mutasi dapat melaporkan tingkat resistensi yang tinggi hingga hilangnya sensitivitas sepenuhnya. Oleh karena itu, peningkatan resistensi populasi terjadi dengan sangat cepat.
Contoh fungisida tersebut adalah fenilamid, termasuk fungisida yang paling umum, metalaksil. Mutasi resistensi terhadapnya terjadi dengan frekuensi tinggi, dan tingkat resistensi pada mutan sangat tinggi - melebihi regangan sensitif dengan faktor seribu atau lebih (Derevyagina et al., 1993). Meskipun laju pertumbuhan dan agresivitas mutan resisten menurun dengan latar belakang kematian galur rentan dari fungisida sistemik, ukuran populasi resisten berkembang pesat dan, secara paralel, agresivitas meningkat. Oleh karena itu, setelah beberapa tahun menggunakan fungisida, agresivitas galur resisten tidak hanya menyamai agresivitas galur sensitif, tetapi juga melampauinya (Derevyagina dan Dyakov, 1992).
Efek pada rekombinasi seksual
Karena kemunculan tipe kawin A2 yang sering pada populasi P. infestans bertepatan dengan penggunaan intensif metalaksil terhadap penyakit busuk daun, dihipotesiskan bahwa metalaksil menginduksi konversi tipe kawin. Dalam P. parasitica, konversi seperti itu di bawah aksi Chloroneb dan metalaxyl terbukti secara eksperimental (Ko, 1994). Sebuah bagian tunggal pada media dengan konsentrasi rendah metalaxyl menyebabkan munculnya isolat homothallic dari strain P. infestans sensitif terhadap metalaxyl dengan tipe kawin A1 (Savenkova dan Cherepnikova-Anikina, 2002). Selama perjalanan berikutnya pada media dengan konsentrasi metalaksil yang lebih tinggi, tidak ada satu pun isolat dari tipe pasangan A2 yang terdeteksi; namun, sebagian besar isolat, ketika disilangkan dengan isolat A2, bukan oospora, membentuk akumulasi miselium yang jelek dan steril. Bagian dari galur resisten yang memiliki tipe kawin A2 pada media dengan konsentrasi metalaksil yang tinggi memungkinkan kami untuk mendeteksi tiga bentuk perubahan tipe kawin: 1) sterilitas lengkap ketika disilangkan dengan isolat A1 dan A2; 2) homotallisme (pembentukan oospora dalam monokultur); 3) konversi tipe kawin A2 ke A1. Dengan demikian, metalaksil dapat menyebabkan perubahan jenis perkawinan pada populasi P. infestans dan, akibatnya, terjadinya rekombinasi seksual di dalamnya.
Pengaruh pada rekombinasi vegetatif
Beberapa gen resistensi antibiotik meningkatkan frekuensi heterokariotisasi hifa dan diploidisasi nuklir (Poedinok dan Dyakov, 1981). Seperti disebutkan sebelumnya, heterokariotisasi hifa selama fusi strain yang berbeda dari P. infestans sangat jarang terjadi karena fenomena ketidakcocokan vegetatif pada jamur ini. Namun, gen untuk resistensi terhadap beberapa antibiotik dapat memiliki efek samping, dinyatakan dalam mengatasi ketidakcocokan vegetatif. Properti ini dimiliki oleh gen resistensi streptomisin dari 1S-1 mutan. Kehadiran mutan tersebut di lapangan populasi phytophthora dapat meningkatkan aliran gen antar strain dan mempercepat adaptasi seluruh populasi untuk varietas baru atau fungisida.
Fungisida dan antibiotik tertentu dapat mempengaruhi frekuensi rekombinasi mitosis, yang juga dapat mengubah frekuensi genotipe dalam populasi. Fungisida benomyl yang banyak digunakan mengikat beta-tubulin, protein dari mana mikrotubulus sitoskeleton dibangun, dan dengan demikian mengganggu proses pemisahan kromosom dalam anafase mitosis, meningkatkan frekuensi rekombinasi mitosis (Hastie, 1970).
Fungisida para-fluorofenilalanin, yang digunakan untuk mengobati penyakit Belanda pada pohon elm, memiliki sifat yang sama. Para-fluorofenilalanin meningkatkan frekuensi rekombinasi pada diploid heterozigot P. infestans (Poedinok et al., 1982).
Perubahan siklik dalam komposisi genotipe populasi dalam siklus hidup P. infestans
Siklus perkembangan klasik P. infestans di daerah beriklim sedang terdiri dari 4 fase.
1) Fase pertumbuhan penduduk secara eksponensial (fase polisiklik) dengan generasi pendek. Fase ini biasanya dimulai pada bulan Juli dan berlangsung selama 1,5-2 bulan.
2) Fase penghentian pertumbuhan populasi karena penurunan tajam dalam proporsi jaringan yang tidak terpengaruh atau timbulnya kondisi cuaca yang tidak menguntungkan. Fase di tambak yang melakukan pemindahan sebelum panen awal ini keluar dari siklus tahunan.
3) Fase musim dingin pada umbi, disertai dengan penurunan yang signifikan dalam ukuran populasi karena infeksi umbi yang tidak disengaja, perkembangan infeksi yang lambat di dalamnya, tidak adanya infeksi ulang pada umbi, pembusukan dan pemusnahan umbi yang terkena dalam kondisi penyimpanan normal .
4) Fase perkembangan lambat di tanah dan pada bibit (fase monosiklik), di mana durasi generasi dapat mencapai satu bulan atau lebih (akhir Mei - awal Juli). Biasanya pada saat ini, daun yang sakit sulit dideteksi, bahkan dengan pengamatan khusus.
Fase pertumbuhan penduduk eksponensial (fase polisiklik)
Banyak pengamatan (Pshedetskaya, Kozubova, 1969; Borisenok, 1969; Osh, 1969; Dyakov, Suprun, 1984; Rybakova, Dyakov, 1990) menunjukkan bahwa pada awal epifit, klon virulen rendah dan sedikit agresif mendominasi, yang kemudian digantikan oleh yang lebih virulen dan agresif, dan laju pertumbuhan agresivitas populasi semakin tinggi, semakin kurang tahan varietas tanaman inangnya.
Dengan bertambahnya populasi, konsentrasi kedua gen penting yang selektif yang diintroduksikan ke dalam varietas komersial (R1-R4) dan selektif netral (R5-R11) meningkat. Jadi, dalam populasi di dekat Moskow pada tahun 1993, virulensi rata-rata dari akhir Juli hingga pertengahan Agustus meningkat dari 8,2 menjadi 9,4, dan peningkatan terbesar diamati untuk gen virulensi selektif netral R5 (dari 31 menjadi 86% klon virulen) ( Smirnov, 1996).
Penurunan laju pertumbuhan suatu populasi disertai dengan penurunan aktivitas parasit dari populasi tersebut. Oleh karena itu, pada tahun-tahun depresi, baik jumlah ras maupun proporsi ras yang sangat ganas lebih rendah daripada ras epifit (Borisenok, 1969). Jika pada puncak kondisi cuaca epifit berubah menjadi tidak menguntungkan untuk penyakit busuk daun dan serangan kentang menurun, maka konsentrasi klon yang sangat virulen dan agresif juga menurun (Rybakova et al., 1987).
Peningkatan frekuensi gen yang mempengaruhi virulensi dan agresivitas populasi mungkin disebabkan oleh pemilihan klon yang lebih virulen dan agresif dalam populasi campuran. Untuk mendemonstrasikan seleksi, metode analisis mutasi netral dikembangkan, yang berhasil digunakan pada populasi chemostat ragi (Adams et al., 1985) dan Fusarium graminearum (Wiebe et al., 1995).
Frekuensi mutan yang resisten terhadap blasticidin S di lapangan populasi P. infestans menurun seiring dengan pertumbuhan agresivitas populasi yang menunjukkan adanya perubahan klon dominan dalam proses pertumbuhan populasi (Rybakova et al., 1987). ).
Fase musim dingin di umbi
Selama musim dingin pada umbi kentang, virulensi dan agresivitas strain P. infestans menurun, dan penurunan virulensi terjadi lebih lambat daripada agresivitas (Rybakova dan Dyakov, 1990). Rupanya, dalam kondisi yang kondusif untuk pertumbuhan populasi yang cepat (r-seleksi), gen virulensi "ekstra" dan agresivitas tinggi berguna, oleh karena itu pengembangan epifitosis disertai dengan pemilihan klon yang paling ganas dan agresif. Dalam kondisi kejenuhan lingkungan, ketika bukan kecepatan reproduksi, tetapi kelangsungan hidup dalam kondisi yang tidak menguntungkan (seleksi K) memainkan peran penting, gen "tambahan" dari virulensi dan agresivitas mengurangi kebugaran, dan klon dengan gen ini yang pertama mati, sehingga rata-rata agresivitas dan virulensi populasi turun.
Fase vegetasi di dalam tanah
Fase ini merupakan fase yang paling misterius dalam siklus hidup (Andrivon, 1995). Keberadaannya didalilkan murni spekulatif - karena kurangnya informasi tentang apa yang terjadi pada patogen dalam waktu yang lama (kadang-kadang lebih dari sebulan) - dari munculnya bibit kentang hingga munculnya bintik-bintik pertama penyakit pada mereka. Berdasarkan pengamatan dan percobaan, perilaku jamur pada periode kehidupan ini direkonstruksi (Hirst dan Stedman, 1960; Boguslavskaya, Filippov, 1976).
Sporulasi jamur dapat terbentuk pada umbi yang terinfeksi di tanah. Spora yang dihasilkan berkecambah dengan hifa, yang dapat tumbuh lama di tanah. Spora primer (terbentuk pada umbi) dan sekunder (pada miselium di tanah) naik ke permukaan tanah oleh arus kapiler, tetapi memperoleh kemampuan untuk menginfeksi kentang hanya setelah daun bagian bawah turun dan bersentuhan dengan permukaan tanah. Daun seperti itu (yaitu, bintik-bintik pertama penyakit ditemukan pada mereka) tidak segera terbentuk, tetapi setelah pertumbuhan dan perkembangan pucuk kentang yang berkepanjangan.
Dengan demikian, fase vegetasi saprotrofik juga dapat eksis dalam siklus hidup P. infestans. Jika dalam fase parasit dari siklus hidup agresivitas adalah komponen kebugaran yang paling penting, maka dalam seleksi fase saprotrofik ditujukan untuk mengurangi sifat parasit, seperti yang ditunjukkan secara eksperimental untuk beberapa jamur fitopatogen (lihat Carson, 1993). Oleh karena itu, dalam fase siklus ini, sifat agresif harus dihilangkan paling intensif. Namun sejauh ini tidak ada eksperimen langsung yang dilakukan untuk mengkonfirmasi asumsi di atas.
Perubahan musim tidak hanya mempengaruhi sifat patogen P. infestans, tetapi juga ketahanan terhadap fungisida, yang tumbuh pada fase polisiklik (selama epifit) dan menurun selama penyimpanan musim dingin (Derevyagina et al., 1991; Kadish dan Cohen, 1992). Penurunan resistensi yang sangat kuat terhadap metalaksil diamati pada periode antara penanaman umbi yang terkena dan munculnya bintik-bintik pertama penyakit di lapangan.
Spesialisasi intraspesifik dan evolusinya
P. infestans menyebabkan epidemi pada dua tanaman komersial penting, kentang dan tomat. Epiphytoties pada kentang dimulai segera setelah jamur memasuki area baru. Kekalahan tomat juga dicatat segera setelah munculnya infeksi pada kentang, tetapi epifit pada tomat hanya dicatat seratus tahun kemudian - di pertengahan abad ke-XNUMX. Inilah yang Hallegli dan Niederhauser tulis tentang kekalahan tomat di AS
(1962): “Selama sekitar 100 tahun setelah epifitoti yang parah pada tahun 1845, sedikit atau hampir tidak ada upaya yang dilakukan untuk mendapatkan varietas tomat yang tahan. Meskipun penyakit busuk daun pertama kali terdaftar pada tomat pada awal tahun 1848, penyakit ini tidak menjadi perhatian serius para pemulia tanaman ini sampai wabah penyakit yang kuat terjadi pada tahun 1946. Di wilayah Rusia, penyakit busuk daun tomat terdaftar pada abad ke-60. “Untuk waktu yang lama, para peneliti tidak memperhatikan penyakit ini, karena tidak menyebabkan kerusakan ekonomi yang signifikan. Tapi di tahun 70-an dan 1979-an. Epiphytoties abad XX dari penyakit busuk daun pada tomat juga diamati di Uni Soviet, terutama di wilayah Volga Bawah, di Ukraina, Kaukasus Utara, di Moldova ... ”(Balashova, XNUMX).
Sejak itu, penyakit busuk daun tomat telah menjadi tahunan, telah menyebar ke seluruh wilayah industri dan budidaya rumah dan menyebabkan kerusakan ekonomi yang sangat besar pada tanaman ini. Apa yang terjadi? Mengapa kemunculan pertama parasit pada kentang dan lesi epifitosis pada kultur ini terjadi hampir bersamaan, dan mengapa perlu waktu satu abad agar epifitosis muncul pada tomat? Perbedaan-perbedaan ini mendukung sumber infeksi Meksiko daripada Amerika Selatan. Jika spesies Phytophthora infestans berkembang sebagai parasit spesies penghasil umbi Meksiko dari genus Solanum, maka dapat dimengerti mengapa kentang budidaya yang termasuk dalam bagian genus yang sama dengan spesies Meksiko sangat terpengaruh, tetapi karena tidak adanya ko-evolusi dengan parasit, yang tidak mengembangkan mekanisme resistensi spesifik dan nonspesifik.
Tomat termasuk dalam bagian genus yang berbeda, jenis pertukarannya memiliki perbedaan yang signifikan dari spesies umbi, oleh karena itu, meskipun tomat tidak berada di luar spesialisasi makanan P. infestans, intensitas kekalahannya tidak mencukupi. untuk kerugian ekonomi yang serius.
Munculnya epifit pada tomat disebabkan oleh perubahan genetik yang serius pada parasit, yang meningkatkan kemampuan beradaptasi (patogenisitas) selama parasitisme. Kami percaya bahwa bentuk khusus yang baru untuk parasitisasi tomat adalah ras T1 yang dijelaskan oleh M. Gallegly, mempengaruhi varietas tomat ceri (Red Cherry, Ottawa), tahan terhadap ras T0 yang tersebar luas pada kentang (Gallegly, 1952). Rupanya, mutasi (atau serangkaian mutasi) yang mengubah ras T0 menjadi ras T1 dan menyebabkan munculnya klon yang sangat beradaptasi dengan kekalahan tomat. Seperti yang sering terjadi, peningkatan patogenisitas ke satu inang disertai dengan penurunannya ke yang lain, yaitu, spesialisasi intraspesifik awal yang belum lengkap muncul - untuk kentang (ras T0) dan tomat (ras T1).
Apa bukti untuk mendukung asumsi ini?
- Terjadi pada kentang dan tomat. Pada daun tomat ras T1 mendominasi, sedangkan pada daun kentang jarang. Menurut S.F.Bagirova dan T.A. Oreshonkova (tidak diterbitkan) di wilayah Moskow pada 1991-1992, terjadinya ras T1 pada penanaman kentang adalah 0%, dan pada penanaman tomat - 100%; pada 1993-1995 - masing-masing 33% dan 90%; pada tahun 2001 - 0% dan 67%. Data serupa diperoleh di Israel (Cohen, 2002). Percobaan infeksi umbi kentang dengan isolat ras T1 dan campuran isolat T0 dan T1 menunjukkan bahwa isolat ras T1 kurang terawetkan dalam umbi dan digantikan oleh isolat ras T0 (Dyakov et al., 1975; Rybakova, 1988).
2) Dinamika ras T1 pada pertanaman tomat. Infeksi primer daun tomat dilakukan oleh isolat ras T0, yang mendominasi analisis infeksi pada bercak pertama yang terbentuk pada daun. Ini menegaskan skema migrasi parasit yang diterima secara umum: Massa utama infeksi dari kentang terdiri dari ras T0, namun, sejumlah kecil klon T1 yang diawetkan dalam kentang, sekali pada tomat, menggantikan ras T0 dan terakumulasi ke arah akhir periode epifitosis. Kemungkinan juga terdapat sumber alternatif infeksi daun tomat dengan ras T1, tidak sekuat umbi dan daun kentang, tetapi konstan. Oleh karena itu, sumber ini memiliki sedikit pengaruh pada struktur genetik populasi yang menginfeksi tomat, tetapi selanjutnya menentukan akumulasi ras T1 (Rybakova, 1988; Dyakov et al., 1994).
3) Agresivitas terhadap kentang dan tomat. Infeksi buatan tomat dan daun kentang dengan isolat ras T0 dan T1 menunjukkan bahwa yang pertama lebih agresif untuk kentang daripada tomat, dan yang terakhir lebih agresif untuk tomat daripada kentang. Perbedaan-perbedaan ini dimanifestasikan dalam perpindahan isolat ras non-"sendiri" dari populasi campuran selama perjalanan pada daun di rumah kaca (Dyakov et al., 1975) dan di plot lapangan (Leberton et al., 1999); perbedaan dalam beban infeksi minimum, periode latensi, ukuran tempat infeksi dan produksi spora (Rybakova, 1988; Dyakov et al., 1994; Legard et al., 1995; Forbes et al., 1997; Oyarzun et al., 1998; Leberton dkk., 1999; Vega-Sanchez dkk., 2000; Knapova, Gisi, 2002; Sussuna dkk., 2004).
Agresivitas isolat ras T1 terhadap varietas tomat yang tidak memiliki gen ketahanan sangat tinggi sehingga isolat tersebut berspora pada daun seperti pada media nutrisi tanpa nekrosis jaringan yang terinfeksi (Dyakov et al., 1975; Vega-Sanchez et al., 2000) .
4) Virulensi untuk kentang dan tomat. Ras T1 mempengaruhi varietas tomat ceri dengan gen ketahanan Ph1, sedangkan ras T0 tidak mampu menginfeksi varietas tersebut, yaitu. memiliki virulensi yang lebih sempit. Dalam kaitannya dengan pembeda
Gen-R kentang berkerabat terbalik, yaitu galur yang diisolasi dari daun tomat kurang ganas dibandingkan galur "kentang" (Tabel 11).
5) Penanda netral. Analisis penanda netral pada populasi parasit P. infestans pada kentang dan tomat juga membuktikan seleksi intraspesifik multi arah. Pada populasi P. infestans Brasil, isolat daun tomat termasuk dalam galur klonal US-1, dan isolat dari daun kentang termasuk dalam galur BR-1 (Suassuna et al., 2004). Di Florida (AS), sejak tahun 1994, klon US-90 mulai mendominasi pada kentang (dengan kejadian lebih dari 8%), dan klon US-11 dan US-17 pada tomat, dan isolat yang terakhir lebih agresif untuk tomat. dibandingkan kentang (Weingartner , Tombolato, 2004). Perbedaan signifikan dalam frekuensi genotipe (sidik jari DNA) pada isolat kentang dan tomat ditemukan untuk 1200 galur P. infestans yang dikumpulkan di Amerika Serikat dari tahun 1989 hingga 1995 (Deahl et al., 1995).
Menggunakan metode AFLP memungkinkan untuk memisahkan 74 galur yang dikumpulkan dari kentang dan daun tomat pada tahun 1996-1997. di Perancis dan Swiss, menjadi 7 kelompok. Strain kentang dan tomat tidak jelas berbeda, tetapi strain "kentang" ternyata secara genetik lebih beragam daripada "tomat". Yang pertama ditemukan di semua tujuh kelompok, dan yang terakhir, hanya dalam empat, yang menunjukkan genom yang lebih khusus dari yang terakhir (Knapova dan Gisi, 2002).
6) Mekanisme isolasi. Jika populasi parasit pada dua spesies tanaman inang berevolusi menuju penyempitan spesialisasi ke inangnya sendiri, maka berbagai mekanisme pra dan pascameiosis muncul yang mencegah pertukaran genetik antarpopulasi (Dyakov dan Lekomtseva, 1984).
Beberapa penelitian telah menyelidiki pengaruh sumber galur induk pada efisiensi hibridisasi. Ketika melintasi galur yang diisolasi dari spesies yang berbeda dari genus Solanum di Ekuador (Oliva et al., 2002), ditemukan bahwa galur dengan tipe kawin A2 dari Solanaceae liar (garis klon EC-2) melintasi yang terburuk dengan galur dari tomat ( galur EC -3), dan paling efektif disilangkan dengan galur kentang (EC-1).
Semua hibrida ditemukan non-patogen. Para penulis percaya bahwa rendahnya persentase hibridisasi dan pengurangan patogenisitas pada hibrida disebabkan oleh mekanisme pascameiosis dari isolasi reproduktif populasi.
Dalam percobaan Bagirova dkk (1998), sejumlah besar galur kentang dan tomat disilangkan dengan sifat-sifat ras T0 dan T1. Yang paling subur adalah persilangan galur T1xT1 yang diisolasi dari tomat (36 oospora di bidang pandang mikroskop, 44% perkecambahan oospora), yang paling tidak efektif adalah persilangan ras T0xT1 yang diisolasi dari inang yang berbeda (jumlah oospora berkembang dan berkecambah rendah, proporsi tinggi oospora yang gagal dan kurang berkembang) ... Efisiensi persilangan antar isolat ras T0 yang diisolasi dari kentang ternyata menengah. Karena tubuh utama strain ras T0 mempengaruhi kentang, ia memiliki sumber musim dingin yang andal - umbi kentang, akibatnya pentingnya oospora sebagai unit infeksi musim dingin untuk populasi dari kentang rendah. "Bentuk tomat" yang diadaptasi dapat bertahan pada tomat dalam bentuk oospora (lihat di bawah) dan karenanya mempertahankan produktivitas proses seksual yang lebih tinggi. Karena kesuburannya yang tinggi, T1 memperoleh potensi independen untuk infeksi primer pada tomat. Hasil yang diperoleh Knapova et al (Knapova et al., 2002) dapat diinterpretasikan dengan cara yang sama. Persilangan galur yang diisolasi dari kentang dengan galur dari tomat menghasilkan jumlah oospora tertinggi - 13,8 per mm persegi. medium (dengan penyebaran 5-19) dan persentase perkecambahan oospora sedang (6,3 dengan penyebaran 0-24). Persilangan galur yang diisolasi dari tomat memberikan persentase oospora terendah (7,6 dengan penyebaran 4-12) dengan persentase perkecambahan tertinggi (10,8). Persilangan antara galur yang diisolasi dari kentang menghasilkan jumlah oospora sedang (8,6 dengan sebaran data yang tinggi - 0-30) dan persentase perkecambahan oospora terendah (2,7). Dengan demikian, galur dari kentang kurang subur dibandingkan dengan yang berasal dari tomat, tetapi persilangan antarpopulasi tidak memberikan hasil yang lebih buruk daripada yang intrapopulasi. Ada kemungkinan perbedaan dengan data di atas menurut Bagirova dkk. dijelaskan oleh fakta bahwa peneliti Rusia bekerja dengan galur yang diisolasi pada awal 90-an abad ke-90, dan peneliti Swiss - dengan galur yang diisolasi pada akhir XNUMX-an.
Kesuburan yang rendah mungkin disebabkan oleh heteroploidi dari galur. Jika dalam populasi Meksiko, di mana proses seksual dan infeksi primer dengan keturunan oospora teratur, sebagian besar galur P. Infestans yang dipelajari adalah diploid, maka di negara-negara Dunia Lama polimorfisme ploidi intrapopulasi diamati (di-, tri- dan strain tetraploid, serta strain heterokariotik dengan inti heteroploid) , dan strain memiliki jenis perkawinan yang berbeda, yaitu. saling subur, berbeda dalam ploidi nukleus (Therrien et al., 1989, 1990; Whittaker et al., 1992; Ritch, Daggett, 1995). Keanekaragaman inti pada antheridia dan oogonia dapat menyebabkan rendahnya fertilitas.
Adapun pertukaran nuklir antara hifa selama anastomosis, ini terhalang oleh ketidakcocokan vegetatif, yang membagi populasi aseksual menjadi banyak klon yang terisolasi secara genetik (Poedinok dan Dyakov, 1987; Gorbunova et al., 1989; Anikina et al., 1997b).
7) Konvergensi populasi. Data di atas menunjukkan bahwa hibridisasi antara galur "kentang" dan "tomat" dari P. infestans dimungkinkan. Infeksi ulang timbal balik dari inang yang berbeda juga dimungkinkan, meskipun dengan agresivitas yang berkurang.
Sebuah studi penanda populasi pada isolat dari ladang kentang dan tomat yang berdekatan pada tahun 1993 menunjukkan bahwa sekitar seperempat isolat yang diisolasi dari daun tomat dipindahkan dari ladang kentang yang berdekatan (Dolgova et al., 1997). Secara teoritis, dapat diasumsikan bahwa divergensi populasi pada dua inang akan meningkat dan menyebabkan munculnya bentuk intraspesifik khusus (kentang f.sp. dan tomat f.sp.), terutama karena oospora dapat bertahan di sisa-sisa tanaman (Drenth et al., 1995; Bagirova, Dyakov, 1998) dan biji tomat (Rubin et al., 2001). Akibatnya, tomat saat ini memiliki sumber regenerasi musim semi yang tidak bergantung pada umbi kentang.
Namun, semuanya terjadi secara berbeda. Overwintering dengan oospora memungkinkan parasit untuk menghindari tahap tersempit dalam siklus hidupnya - tahap monosiklik vegetasi di tanah, di mana sifat parasit menurun, yang secara bertahap dipulihkan di musim panas dalam fase polisiklik.
Tabel 11. Frekuensi gen virulensi varietas pembeda kentang pada galur P. infestans
Negara | Tahun | Jumlah rata-rata gen virulensi dalam galur | Penulis | |
dari kentang | dari tomat | |||
Perancis | 1995 | 4.4 | 3.3 | Leberton dkk., 1999 |
1996 | 4.8 | 3.6 | Leberton, Andrivon, 1998 | |
Prancis, Swiss | 1996-97 | 6.8 | 2.9 | Knapova, Gisi, 2002 |
AS | 1989-94 | 5 | 4.8 | Goodwin et al., 1995 |
Amerika Serikat, Zap. Washington | 1996 | 4.6 | 5 | Dorrance et al., 1999 |
1997 | 6.3 | 3.5 | " | |
Ekuador | 1993-95 | 7.1 | 1.3 | Oyarzun dkk., 1998 |
Israel | 1998 | 7 | 4.8 | Cohen, 2002 |
1999 | 6 | 5.7 | " | |
2000 | 6.7 | 6.1 | " | |
Rusia, Mosk. wilayah | 1993 | 8.9 | 6.7 | Smirnov, 1996 |
Rusia, berbagai wilayah | 1995 | 9.4 | 8 | Kozlovskaya dan lainnya. |
1997 | 9.2 | 9.2 | " | |
2000 | 8.7 | 4.8 | " |
Zoosporangia primer dan zoospora, yang berkecambah oospora, memiliki tingkat aktivitas parasit yang tinggi, terutama jika oospora terbentuk secara partenogenetik di bawah pengaruh feromon dari strain dengan jenis perkawinan yang berlawanan. Oleh karena itu, bahan infeksius pada bibit tomat yang ditanam dari biji yang terinfeksi oospora sangat patogen baik untuk tomat maupun kentang.
Perubahan ini menyebabkan restrukturisasi populasi lainnya, yang dinyatakan dalam perubahan penting berikut dari sudut pandang epidemiologi:
- Bibit tomat yang terinfeksi telah menjadi sumber penting infeksi primer kentang (Filippov, Ivanyuk, pesan pribadi).
- Epiphytoties pada kentang mulai diamati pada awal Juni, sekitar sebulan lebih awal dari biasanya.
- Pada penanaman kentang, persentase ras T1 meningkat, yang sebelumnya ditemui di sana dalam jumlah yang tidak signifikan (Ulanova et al., 2003).
- Strain yang diisolasi dari daun tomat tidak lagi berbeda dari strain kentang dalam hal virulensi pada kentang pembeda gen virulensi dan mulai mengungguli strain “kentang” dalam agresivitas tidak hanya pada tomat, tetapi juga pada kentang (Lavrova et al., 2003; Ulanova et al., 2003).
Jadi, alih-alih divergensi, yang terjadi adalah konvergensi populasi, munculnya populasi tunggal pada dua tanaman inang dengan virulensi dan agresivitas tinggi pada kedua spesies.
Kesimpulan
Jadi, meskipun lebih dari 150 tahun studi intensif P. infestans, dalam biologi, termasuk biologi populasi agen penyebab penyakit paling penting dari tanaman solanaceous yang dibudidayakan, masih banyak yang belum diketahui. Tidak jelas bagaimana berlalunya tahap individu dari siklus hidup mempengaruhi struktur populasi, apa mekanisme genetik dari variabilitas tersalurkan agresivitas dan virulensi, apa rasio sistem reproduksi dan klonal reproduksi pada populasi alami, bagaimana ketidakcocokan vegetatif diwariskan, apa peran kentang dan tomat dalam infeksi utama tanaman ini dan apa pengaruhnya terhadap struktur populasi parasit. Sampai saat ini, masalah praktis yang penting seperti mekanisme genetik untuk mengubah agresivitas parasit atau erosi resistensi kentang nonspesifik belum terselesaikan. Dengan pendalaman dan perluasan penelitian tentang penyakit busuk daun kentang, parasit menimbulkan tantangan baru bagi para peneliti. Namun, peningkatan kemampuan eksperimental, munculnya pendekatan metodologis baru untuk manipulasi dengan gen dan protein memungkinkan kita untuk mengharapkan solusi yang berhasil dari pertanyaan yang diajukan.
Artikel tersebut dipublikasikan di jurnal "Potato Protection" (No. 3, 2017)