D. Yu. Ryazantsev, E. M. Chudinova, L. Yu. Kokaeva, S. N. Elansky, P. N. Balabko, G. L. Belova, S. K. Zavriev
Jamur fitopatogenik Colletotrichum coccodes menyebabkan penyakit berbahaya pada kentang dan tomat, yang dikenal sebagai antraknosa dan bercak hitam umbi. Berdasarkan ciri morfologinya, penyakit ini seringkali sulit dibedakan dengan penyakit yang disebabkan oleh mikroorganisme lain; Pada buah tomat hijau, penyakit ini tidak menunjukkan gejala, hanya muncul pada buah merah yang matang. Untuk diagnosis patogen yang cepat dan akurat, ditawarkan sistem pengujian PCR waktu nyata. Untuk mengembangkan sistem pengujian, urutan nukleotida gen gliserol trifosfat dehidrogenase ditentukan untuk 45 strain C. coccodes yang diisolasi dari umbi kentang di berbagai wilayah di Rusia.
Berdasarkan hasil yang diperoleh dan analisis urutan serupa dari spesies lain yang tersedia di database GenBank, primer spesifik spesies dan penyelidikan dirancang untuk C. coccodes. Untuk memeriksa spesifisitas sistem pengujian yang dibuat, PCR dilakukan dengan DNA yang diisolasi dari kultur murni 15 spesies jamur parasit dan saprotrofik berbeda yang berasosiasi dengan tanaman tomat dan kentang (Fusarium oxysporum, F. verticillium, Phomopsisphaseoli, Alternaria alternata, Helminthosporium solani , Colletotrichum coccodes, Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Helminthosporium solani, Phomopsisphaseoli, Neonectria radicicola, Rhizoctonia solani, Penicillium sp., Cladosporium fulvum, C. cladosporioides). Keberadaan DNA Colletotrichum coccodes terdeteksi pada siklus ambang batas 20-27, sedangkan spesies lain terdeteksi setelah 40 siklus atau tidak terdeteksi. Sistem pengujian ini memungkinkan Anda mendeteksi dengan andal konsentrasi DNA C. coccodes yang melebihi 0.01 ng/mm3 dalam campuran PCR yang dianalisis. Dengan menggunakan sistem pengujian yang dikembangkan, keberadaan C. coccodes dipelajari pada daun tomat dengan gejala penyakit jamur dan pada umbi kentang tanpa gejala eksternal penyakit. Daun dengan gejala infeksi jamur dikumpulkan dari dua ladang berbeda di wilayah Krasnodar, umbi-umbian - dari ladang di wilayah Kostroma, Moskow, Kaluga, dan Nizhny Novgorod. Di wilayah Krasnodar, ditemukan satu daun tomat yang mengandung DNA C. coccodes; keberadaan DNA patogen ini yang dapat diandalkan terdeteksi pada 5 sampel umbi-umbian yang ditanam di wilayah Kostroma, Moskow, dan Kaluga.
pengenalan
Jamur dari genus Colletotrichum adalah fitopatogen berbahaya yang menyerang biji-bijian, sayuran, herba, serta tanaman buah dan beri abadi. Salah satu spesies genus ini yang ada di mana-mana, Colletotrichum coccodes (Wallr).
Hughes, adalah agen penyebab antraknosa dan bintik hitam pada kentang dan tomat, dan menyebabkan penyakit pada sejumlah tanaman lain dari keluarga nightshade, termasuk. gulma (Dillard, 1992). C. coccodes menginfeksi seluruh bagian bawah tanah tanaman, pangkal batang, daun dan buah (Andrivon et al., 1998; Johnson, 1994). Pada kulit umbi kentang yang terinfeksi, timbul bintik-bintik abu-abu dengan tepi yang tidak jelas, di mana bintik-bintik hitam sporulasi dan mikrosklerotia terlihat jelas. Selama penyimpanan, bisul dengan isi yang melunak dapat terbentuk di dalam daging umbi, mis. penyakit ini memasuki fase antraknosa, namun sangat jarang terjadi.
Sementara itu, gejala antraknosa (bisul yang ditutupi kulit dengan titik-titik hitam kecil) merupakan ciri khas buah tomat. Pada daun, gejala lesi C. coccodes tampak berupa bercak coklat tua, biasanya dibatasi jaringan kuning (Johnson, 1994).
Berkembangnya bercak hitam pada umbi-umbian merusak penampilannya, yang terutama terlihat saat menjual kentang berkulit merah yang sudah dicuci. Pemisahan kulit menyebabkan penguapan berlebih dan peningkatan kehilangan penyimpanan (Hunger dan McIntyre, 1979). Kerusakan pada organ tanaman lainnya menyebabkan hilangnya hasil, yang terjadi baik pada kondisi lahan terbuka maupun tertutup (Johnson, 1994; Tsror et al., 1999). Penyakit yang disebabkan oleh C. coccodes umum terjadi di hampir seluruh wilayah penghasil kentang di dunia, termasuk Rusia (Leesa, Hilton, 2003; Belov et al, 2018). Pengendalian terhadap penyakit-penyakit ini sulit dilakukan karena kurangnya efektivitas fungisida yang ada terhadap C. coccodes dan kurangnya varietas yang tahan (Read and Hide, 1995).
Inokulum C. coccodes dapat diawetkan dalam benih umbi (Read and Hide, 1988; Johnson et al., 1997), benih tomat (Ben-Daniel et al., 2010), dan bertahan lama di dalam tanah dan tanah. pada sisa-sisa tanaman (Dillard, 1990; Dillard, Cobb, 1993) dan gulma (Raid, Pennypacker, 1987). Karya sejumlah penulis (Read, Hide, 1988; Barkdoll, Davis, 1992; Johnson et al., 1997; Dillard, Cobb, 1993) menunjukkan bahwa perkembangan penyakit pada kentang dan tomat sangat bergantung pada keberadaan inokulum dalam bahan benih dan dalam tanah. Oleh karena itu, untuk meminimalkan kerugian akibat penyakit ini, perlu dilakukan diagnosis (termasuk kuantitatif) bibit jamur pada bahan benih, di tanah, pada umbi benih kentang dan benih tomat yang disimpan untuk disimpan. Diagnostik morfologi pada tanah dan bahan tanaman hanya dapat dilakukan dengan adanya mikrosklerotia, namun juga ditemukan pada jenis jamur lainnya.
Gejala pada umbi-umbian sangat mirip dengan keropeng perak yang disebabkan oleh jamur Helminthosporium solani. Isolasi Colletotrichum coccodes dan Helminthosporium solani ke dalam kultur murni cukup sulit dan memakan waktu lama karena lambatnya pertumbuhan pada media nutrisi. Untuk mengidentifikasi coccodes Colletotrichum dengan cepat, perlu menggunakan metode diagnostik instrumental. Metode yang paling mudah adalah reaksi berantai polimerase (PCR) dan modifikasinya - PCR waktu nyata. Saat ini, di Eropa dan Amerika, sistem pengujian yang dikembangkan oleh peneliti Inggris (Cullen et al., 2002) untuk wilayah rDNA ITS1 digunakan. Penggunaannya juga menunjukkan hasil yang baik dalam analisis isolat Rusia (Belov et al, 2018). Namun, C. coccodes sangat bervariasi dan pendeteksiannya menggunakan rangkaian DNA tunggal dapat memberikan hasil negatif palsu. Untuk keandalan diagnostik yang lebih baik, analisis beberapa urutan DNA spesifik spesies diperlukan, dan oleh karena itu kami telah mengembangkan sistem pengujian asli yang memungkinkan kami mengidentifikasi C. coccodes berdasarkan urutan gen gliseraldehida-3-fosfat dehidrogenase.
Bahan dan metode
Untuk menilai efektivitas dan spesifisitas sistem pengujian yang dibuat, digunakan kultur murni dari 15 spesies jamur yang diisolasi oleh penulis dari sampel daun dan buah tomat serta umbi kentang yang terkena dampak (Tabel 1). Untuk isolasi, diambil organ tanaman yang memiliki gejala infeksi jamur, tidak lebih dari satu organ per semak.
Bagian umbi yang dikupas, potongan buah tomat, atau daun yang terkena ditempatkan di bawah mikroskop binokular, setelah itu miselium, spora atau sepotong jaringan dipindahkan ke media agar (wort agar) dalam cawan Petri dengan jarum bedah yang tajam. Isolat disimpan pada agar miring dalam tabung reaksi pada suhu 4°C.
Sampel daun tomat yang dimaksudkan untuk dianalisis dengan gejala penyakit jamur segera setelah dikumpulkan (di lapangan) ditempatkan dalam etil alkohol 70% dan disimpan hingga ekstraksi DNA. Umbi kentang dikirim ke laboratorium, dikupas (potongan 2 × 1 cm) dan dibekukan pada suhu –20°C. Mereka disimpan dalam keadaan beku sampai ekstraksi DNA.
Kultur murni jamur untuk ekstraksi DNA ditanam dalam media kacang cair. Miselium jamur dikeluarkan dari media cair, dikeringkan pada kertas saring, dibekukan dalam nitrogen cair, dihomogenisasi, diinkubasi dalam buffer CTAB, dimurnikan dengan kloroform, diendapkan dengan campuran isopropanol dan kalium asetat 0.5 M, dan dicuci dua kali dengan alkohol 2%. . DNA yang dihasilkan dilarutkan dalam air deionisasi dan disimpan pada suhu –70°C (Kutuzova et al., 20). Konsentrasi DNA diukur menggunakan kit kuantifikasi DNA HS untuk DNA beruntai ganda pada Qubit 2017 (Qiagen, Jerman). Sampel yang diawetkan dan dibekukan digiling dalam nitrogen cair, kemudian DNA diisolasi seperti dijelaskan di atas (untuk miselium kultur jamur murni).
Tabel 1. Asal strain jamur yang digunakan dalam penelitian ini
Nama jamurnya | tumbuhan, organ | Tempat pemilihan |
---|---|---|
Colletotrichum coccodes 1, C. coccodes 2, C. coccodes 3, Ilyonectria crassa, Rhizoctonia solani | umbi kentang | Wilayah Kostroma, umbi kentang generasi pertama, varietas Red Scarlett |
Kokode Colletotrichum 4 | daun kentang | Reputasi. Mari El, Yoshkar-Ola |
Helminthosporium solani | umbi kentang | Wilayah Magadan, pos. Tenda, umbi kentang |
Cladosporium fulvum | daun tomat | Wilayah Moskow, tomat berbuah besar |
Alternaria tomatofila | buah tomat | ditransfer oleh karyawan laboratorium mikologi dan fitopatologi dari Institut Penelitian Perlindungan Tanaman Seluruh Rusia |
Fusarium verticillium, Phomopsisphaseoli, Alternaria alternata, Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Cladosporium cladosporioides, Acrodontium luzulae, Penicillium sp. | buah tomat | Wilayah Krasnodar, distrik Krimea, varietas Slivka |
Fusarium oxysporum | akar gandum | Wilayah Moskow |
PCR dilakukan dengan menggunakan penguat DTprime (DNA-Technology). Untuk melakukan PCR, kami menggunakan primer asli dan probe untuk wilayah spesifik spesies dari gen gliserol trifosfat dehidrogenase: primer maju Coc70gdf –TCATGATATCATTTCTCTCACGCA, primer terbalik Coc280gdr – TACTTGAGCATGTAGGCCTGGGA, probe Cocgdz – (BHQ1)-AGTGTGCTTGAGA-(FAMdT)- GGGCTGCTGCCG(p). Primer memperkuat wilayah 213 bp.
Reaksi tersebut melibatkan 50 ng total DNA (saat menganalisis daun dan umbi) dan 10 ng (saat menganalisis DNA dari kultur jamur murni). Campuran reaksi (35 μl) dibagi menjadi dua bagian dengan lapisan parafin: bagian bawah (20 μl) mengandung 2 μl buffer reaksi 10× (750 mM Tris-HCl, pH 8.8; 200 mM (NH4)2SO4; 25 mM MgCl2;0.1% Tween-20), masing-masing 0.5 mM deoksinukleotida trifosfat, masing-masing 7 pmol primer dan 4 pmol probe fluoresen yang dapat dihidrolisis; yang atas berisi 1 μl buffer 10x PCR dan 1 unit Taq polimerase.
Pemisahan campuran dengan parafin memungkinkan tabung disimpan dalam waktu lama pada suhu 5°C dan memastikan permulaan PCR yang panas setelah dipanaskan selama 10 menit pada suhu di atas 80°C. PCR dilakukan dengan program sebagai berikut: 94.0°C – 90 detik (1 siklus); 94.0°C – 30 detik; 64.0°C – 15 detik (5 siklus); 94.0°C – 10 detik; 64.0°C – 15 detik (45 siklus); 10.0°C – penyimpanan.
hasil dan Diskusi
Urutan gen gliserol trifosfat dehidrogenase ditentukan pada 45 strain yang diisolasi dari daun, batang, umbi kentang, dan buah tomat (Kutuzova, 2018) di berbagai wilayah di Rusia. Urutan semua strain yang dipelajari dibagi menjadi 2 kelompok, berbeda dalam dua nukleotida. Urutan nukleotida perwakilan kedua kelompok telah disimpan di GenBank dengan nomor KY496634 dan KY496635.
Primer coc70gdf, coc280gdr dan probe cocgdz yang dibuat berdasarkan mereka diperiksa menggunakan program BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) pada semua rangkaian gen gliserol trifosfat dehidrogenase yang tersedia di database GenBank dari spesies genus Colletotrichum dan organisme lain.
Tidak ada wilayah DNA organisme lain yang sangat homolog dengan primer dan probe yang ditemukan.
Sensitivitas sistem pengujian diuji menggunakan sampel dengan konsentrasi DNA C. coccodes yang berbeda, DNA dari daun kentang yang terkena antraknosa (dikumpulkan pada tahun 2017 di Mari El, varietas Red Scarlett), dan kulit umbi yang terkena bercak hitam (dikumpulkan di wilayah Kostroma, varietas Red Scarlett, Tabel 2). Untuk memastikan keberadaan DNA pada umbi dan daun kentang, strain C. coccodes diisolasi ke dalam kultur murni.
Hasil analisis sensitivitas sistem pengujian menunjukkan bahwa sistem ini dapat berhasil mendiagnosis keberadaan DNA C. coccodes dalam suatu sampel jika kandungan totalnya dalam campuran PCR lebih dari 0.05 ng. Ini cukup cukup untuk dideteksi, karena satu sklerotia mengandung rata-rata 0.131 ng, dan satu spora mengandung sekitar 0.04 ng DNA (Cullen et al., 2002). Sistem pengujian yang dikembangkan oleh kelompok Inggris (Cullen et al., 2002) menunjukkan sensitivitas yang serupa (siklus ambang batas 34 pada 0.05 ng DNA dan 37 pada 0.005 ng).
Analisis sampel alami yang mengandung C. coccodes dalam semua kasus memungkinkan untuk mendeteksi keberadaannya dalam sampel secara andal (Tabel 2). Metode ekstraksi DNA yang diusulkan juga ternyata dapat diterapkan untuk analisis sampel tumbuhan alami.
Tabel 2. Penentuan sensitivitas sistem uji identifikasi Colletotrichum coccodes yang diusulkan untuk PCR real-time
Sampel | Jumlah DNA dalam sampel*, ng | Siklus ambang batas | Deteksi C. coccodes |
---|---|---|---|
Miselium coccodes Colletotrichum | 50 | 21.3 | + |
5 | 25.7 | + | |
0.5 | 29,7 | + | |
0.05 | 33.5 | + | |
0.005 | 40 | - | |
0.0005 | 42.8 | - | |
0.00005 | - | ||
Kulit umbi 1 | 50 | 32 | + |
Kulit umbi 2 | 50 | 30 | + |
Kulit umbi 3 | 50 | 31.5 | + |
daun kentang | 50 | 29.5 | + |
Catatan. *Dalam campuran produk PCR.
Kekhususan sistem pengujian diuji pada sampel DNA yang diekstraksi dari 15 spesies jamur. Semua strain jamur diisolasi oleh penulis dari buah dan daun tomat yang terkena dampak dan sehat, serta umbi kentang; satu strain diisolasi dari akar gandum (Tabel 1). Di antara yang diisolasi dari permukaan buah juga terdapat spesies yang non-patogen terhadap tomat (misalnya Phellinus ferrugineovelutinus).
Penelitian telah menunjukkan bahwa DNA C. coccodes terdeteksi pada siklus ambang batas 20-27, sementara spesies jamur lainnya tidak terdeteksi atau memberikan sinyal setelah siklus 40, yang dapat dikaitkan dengan efek kebisingan nonspesifik (Tabel 3).
Tabel 3. Pengujian sistem uji pada berbagai jenis jamur
Nama jamurnya | Siklus ambang batas |
Coccode colletotrichum 1 | 20.9 |
C.cocodes 2 | 22.6 |
C.cocodes 3 | 23 |
C.cocodes 4 | 22 |
Fusarium oxysporum | > 40 |
F.vertikillium | > 40 |
Rhizoctonia solani | > 40 |
Faseoli Phomopsis | > 40 |
Alternatif alternatif | > 40 |
A. tomatofila | > 40 |
Helminthosporium solani | > 40 |
Phellinus ferrugineovelutinus | > 40 |
Stemphylium vesicarium | > 40 |
Ilyonectria crassa | > 40 |
Cladosporium cladosporioides | > 40 |
C.fulvum | > 40 |
Acrodontium luzulae | > 40 |
Penicillium sp. | > 40 |
Catatan. *Jumlah DNA di semua sampel adalah 10 ng.
Sistem pengujian yang dikembangkan digunakan untuk mengidentifikasi C. coccodes pada sampel daun tomat yang mengalami gejala kerusakan oleh patogen nekrotrofik dan umbi kentang berbiji tanpa gejala yang terlihat. Untuk penelitian ini, diambil umbi bibit dari berbagai varietas yang ditanam di wilayah Kostroma, Moskow, Kaluga, dan Nizhny Novgorod. Kehadiran DNA C. coccodes dianggap dapat diandalkan dalam sampel yang siklus ambang batasnya tidak melebihi 35. Nilai ambang batas ini dipilih berdasarkan deteksi yang dapat diandalkan dari 0.05 ng DNA C. coccodes (siklus ambang 33.5, Tabel 2) dan fakta bahwa ketika Pada siklus ambang batas di atas 40, DNA nonspesifik dari beberapa spesies jamur lain didiagnosis. Dengan pendekatan ini, keberadaan DNA C. coccodes yang andal terdeteksi pada 5 sampel umbi-umbian yang ditanam di wilayah Kostroma, Moskow, Kaluga dan dalam satu daun tomat dari distrik Yeisk di Wilayah Krasnodar (Tabel 4, 5).
Tabel 4. Deteksi coccodes Colletotrichum pada umbi kentang*
Nomor sampel | Varietas kentang | Tempat pertumbuhan | Deteksi C. coccodes | Siklus ambang batas |
---|---|---|---|---|
1 | Merah Merah | wilayah Kostroma | + | 35 |
2 | + | 35 | ||
3 | - | 38 | ||
4 | Sante | Wilayah Moskow | + | 34 |
5 | - | |||
6 | - | 41 | ||
7 | - | 41.8 | ||
8 | + | 30 | ||
9 | Zhukovsky lebih awal | Wilayah Moskow | - | 40.5 |
10 | - | 40.6 | ||
11 | - | |||
12 | Molly | wilayah Kaluga. | + | 34.3 |
13 | - | 38.4 | ||
14 | Fantasi | wilayah Kaluga. | - | |
15 | Gala | wilayah Nizhny Novgorod. | - | |
16 | - |
Catatan. *Jumlah DNA di semua sampel adalah 50 ng.
Tabel 5. Deteksi coccodes Colletotrichum pada daun tomat*
Nomor sampel | Tempat pertumbuhan | Deteksi C. coccodes | Siklus ambang batas |
---|---|---|---|
1 | Wilayah Krasnodar, distrik Krimea | - | |
2 | - | ||
3 | - | ||
4 | - | 45 | |
5 | - | ||
6 | - | ||
7 | - | ||
8 | - | ||
9 | Wilayah Krasnodar, distrik Yeisk | - | 39.2 |
10 | - | 40.8 | |
11 | - | ||
12 | - | 41.6 | |
13 | - | 40 | |
14 | - | 41 | |
15 | - | 41.9 | |
16 | - | ||
17 | - | ||
18 | - | 40.3 | |
19 | - | ||
20 | - | ||
21 | + | 34.5 | |
22 | - | ||
23 | - |
*Jumlah DNA di semua sampel adalah 50 ng.
Sistem pengujian yang kami buat tidak kalah dengan yang dikembangkan oleh peneliti Inggris (Cullen et al., 2002) dalam hal sensitivitas dan spesifisitas dan cocok untuk analisis sampel tanaman. Penggunaannya untuk analisis umbi benih memungkinkan untuk mendeteksi DNA C. coccodes dalam umbi tanpa tanda-tanda kerusakan eksternal dan berhasil menganalisis infeksi daun.
Di Rusia, hingga saat ini, umbi kentang belum dianalisis untuk mengetahui infeksi C. coccodes. Studi pertama kami menunjukkan bahwa dari 16 umbi benih uji yang ditanam di berbagai wilayah di Federasi Rusia, 5 mengandung C. coccodes. Hal ini menunjukkan bahwa bintik hitam pada umbi kentang merupakan penyakit kentang yang umum di Rusia, dan perannya dalam menurunkan volume dan kualitas tanaman kentang masih diremehkan.
Saat menganalisis daun tomat, keberadaan DNA C. coccodes yang dapat diandalkan terdeteksi di satu daun dari distrik Yeisk di Wilayah Krasnodar. Sebelumnya, ketika memeriksa ladang tomat di Rusia selatan menggunakan sistem pengujian Inggris (Cullen et al., 2002), daun yang mengandung C. coccodes diidentifikasi, dan di beberapa ladang ditemukan sebagian besar daun yang terkena C. coccodes (Belov et al., 2018). Di wilayah Krasnodar dan Primorsky serta wilayah Moskow, kami menemukan buah tomat, yang darinya kami dapat mengisolasi kultur murni C. coccodes. Ada kemungkinan bahwa C. coccodes tersebar lebih luas pada tomat di Rusia daripada yang diyakini saat ini, dan bahayanya juga dianggap remeh.
Dengan demikian, hingga saat ini, informasi yang cukup telah terkumpul mengenai penyebaran luas C. coccodes pada kentang dan tomat.
Untuk lebih memahami peran jamur ini dalam perkembangan penyakit kentang dan tomat, diperlukan pemantauan ekstensif terhadap prevalensinya di Rusia, studi tentang peran infeksi tanah dan benih, serta peran bintik hitam dalam kehilangan penyimpanan. Penggunaan diagnostik PCR dapat sangat memudahkan pekerjaan ini, dan penggunaan kedua sistem pengujian secara bersamaan akan meningkatkan akurasi analisis secara signifikan.
Pekerjaan ini didukung oleh hibah Yayasan Sains Rusia No. 18-76-00009.
Artikel tersebut diterbitkan dalam jurnal “Mycology and Phytopathology” (Vol. 54, No. 1, 2020).