MAKAN. Chudinov, V.A. Platonov, A.V. Alexandrova, S.N. Elansky
Baru-baru ini diketahui bahwa jamur ascomycete Ilyonectria crassa mampu menginfeksi umbi kentang. Karya ini adalah yang pertama menganalisis karakteristik biologis dan ketahanan terhadap beberapa fungisida strain I. crassa yang diisolasi dari kentang. Urutan wilayah spesies spesifik dari strain "kentang" bertepatan dengan yang diperoleh sebelumnya untuk jamur yang diisolasi dari akar daffodil, ginseng, aspen dan beech, umbi lily dan daun tulip. Ternyata, banyak tumbuhan liar dan kebun yang bisa menjadi cagar I. crassa. Strain yang diteliti menginfeksi irisan tomat dan kentang, tetapi tidak menginfeksi seluruh buah tomat dan umbi kentang utuh. Hal ini menunjukkan bahwa I. crassa merupakan parasit luka. Evaluasi resistensi terhadap fludioxonil, difenoconazole dan azoxystrobin pada media nutrisi menunjukkan efikasi yang tinggi dari obat ini.
Indikator EC50 (konsentrasi fungisida, yang melambat sebanyak 2 kali laju pertumbuhan radial koloni relatif terhadap pengendalian fungisida) adalah sama dengan 0.4; 7.4 dan 4 mg / l. Kemungkinan berkembangnya penyakit yang disebabkan oleh I. crassa harus diperhitungkan saat penilaian fitopatologi umbi kentang dan pengembangan langkah-langkah perlindungan tanaman.
Perkembangan mikroorganisme fitopatogenik menyebabkan kerugian tinggi di semua tahap pertumbuhan dan penyimpanan kentang. Ketika merencanakan tindakan perlindungan, sebagai suatu peraturan, patogen terkenal diperhitungkan, seperti spesies dari genera Alternaria, Fusarium, Phoma, Helminthosporium, Colletotrichum, Phytophthora, dll. Namun, dalam beberapa tahun terakhir, semakin banyak laporan muncul tentang munculnya mikroorganisme fitopatogenik baru pada kentang. Biologi mereka kurang dipelajari, keefektifan fungisida yang digunakan pada kentang dalam kaitannya dengan mereka tidak diketahui, metode diagnostik belum dikembangkan. Dengan pengembangan massal, mereka mampu menyebabkan kerusakan signifikan pada tanaman kentang. Salah satu mikroorganisme tersebut adalah jamur ascomycete Ilyonectria crassa (Wollenw.) A. Cabral & Crous, pertama kali ditemukan oleh penulis pada umbi kentang (Chudinova et al., 2019).
Karya ini menyajikan hasil analisis strain I. crassa yang diisolasi dari umbi kentang. Morfologi koloni dan struktur miselium I. crassa, urutan nukleotida daerah DNA spesifik spesies, virulensi terhadap kentang dan tomat, dan ketahanan terhadap beberapa fungisida populer dipelajari.
Bahan dan metode
Kami menggunakan strain I. crassa 18KSuPT2 yang diisolasi tahun 2018 dari umbi kentang terinfeksi yang ditanam di wilayah Kostroma. Umbi terkena jenis busuk kering dengan rongga tertutup miselium berwarna coklat muda. Dengan menggunakan jarum bedah steril, miselium jamur dipindahkan ke dalam cawan Petri dengan media agar (bir wort 10%, agar 1.5%, penisilin 1000 U / ml). Pelat diinkubasi dalam gelap pada 24 ° C.
Mikroskop cahaya Leica DM2500 dengan kamera digital ICC50 HD dan mikroskop binokuler Leica M80 dengan kamera digital IC80HD (Leica Microsystems, Jerman) digunakan untuk memotret, menilai ukuran dan morfologi spora dan organ spora.
Untuk mengisolasi DNA, miselium jamur ditumbuhkan dalam media kacang polong cair, kemudian dibekukan dalam nitrogen cair, dihomogenisasi, diinkubasi dalam buffer CTAB, dimurnikan dengan kloroform, dan dicuci dua kali dengan alkohol 2%.
Metode ekstraksi DNA dijelaskan secara rinci dalam artikel oleh Kutuzova et al. (2017).
Untuk menentukan spesies dengan metode molekuler dan membandingkan dengan strain I. crassa lain yang diketahui, PCR dilakukan dengan primer yang memungkinkan amplifikasi wilayah DNA spesifik spesies: ITS1-5,8S-ITS2 (primer ITS5 / ITS4, White et al., 1990), wilayah gen b -tubulin (Bt2a / Bt2b, Glass, Donaldson, 1995) dan faktor perpanjangan translasi 1α (tef1α) (primer EF1-728F / EF1-986R, Carbone dan Kohn, 1999). Amplicon dengan panjang yang diinginkan diekstraksi dari gel menggunakan kit Evrogen CleanUp. Wilayah yang diperkuat diurutkan menggunakan BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, CA, USA) pada pengurut otomatis Terapan Biosystems 3730 xl (Applied Biosystems, CA, USA). Urutan nukleotida yang dihasilkan digunakan untuk mencari kecocokan di database GenBank Pusat Nasional untuk Informasi Bioteknologi (NCBI) AS. Analisis filogenetik dilakukan dengan menggunakan program MEGA 6 (Tamura et al., 2013).
Penentuan virulensi dilakukan pada buah hijau utuh tomat berbuah besar (varietas Dubrava) dan umbi kentang (varietas Gala). Selain itu, untuk mensimulasikan kerusakan buah dan umbi yang rusak, kami menggunakan irisan buah dan umbi yang sama. Irisan umbi ditempatkan di ruang lembab, yaitu cawan petri dengan kertas saring basah di bagian bawah. Sebuah slide ditempatkan di atas kertas, di mana, pada gilirannya, irisan umbi atau buah ditempatkan. Umbi utuh dan buah-buahan juga ditempatkan dalam wadah dengan kertas saring basah di bagian bawah. Di tengah irisan (atau pada permukaan utuh umbi atau buah), sepotong agar (5 × 5 mm) dengan hifa jamur ditempatkan setelah 5 hari tumbuh pada agar wort.
Evaluasi ketahanan galur jamur terhadap fungisida dilakukan pada kondisi laboratorium pada media nutrisi agar. Kami mempelajari kerentanan terhadap obat fungisida Maxim, KS (bahan aktif fludioxonil, 25 g / l), Quadris, KS (azoxystrobin 250 g / l), Scor, EC (difenoconazole 250 g / l) (Katalog negara ..., 2020). Evaluasi dilakukan dalam cawan Petri pada media wort-agar dengan penambahan obat yang diteliti pada konsentrasi zat aktif 0.1; satu; 1 ppm (mg / L) (untuk fludioxonil dan difenoconazole), 10; sepuluh; 1 ppm (untuk azoxystrobin) dan dalam media tanpa fungisida (kontrol). Fungisida ditambahkan ke media leleh yang didinginkan hingga 10 ° C, setelah itu media dituangkan ke dalam cawan petri. Sebuah blok agar dengan miselium jamur ditempatkan di tengah cawan Petri dan dikultur pada suhu 100 ° C di tempat gelap. Setelah 60 hari inkubasi, diameter koloni diukur dalam dua arah yang saling tegak lurus; hasil pengukuran untuk setiap koloni dirata-ratakan. Percobaan dilakukan dalam rangkap tiga. Berdasarkan hasil analisis, EC24 dihitung sama dengan konsentrasi fungisida, yang mengurangi separuh laju pertumbuhan radial koloni relatif terhadap pengendalian fungisida.
hasil dan Diskusi
Pada cawan petri dengan agar wort, jamur membentuk koloni dengan miselium flokulan berwarna putih. Media di bawah miselium berubah menjadi coklat kemerahan. Saat media mengering, jamur membentuk spora dua jenis pada konidiofor tunggal dan agregat dalam sporodochia kecil. Makrokonidia memanjang, silindris, dengan satu sampai tiga septa, panjang rata-rata 27.2 µm dengan kisaran nilai dari 23.2 sampai 32.2 µm, lebar - sampai 4.9 µm (Gbr. 1). Panjang rata-rata mikrokonidia adalah 14.3 µm dengan kisaran nilai 10.3-18.1 µm, lebarnya mencapai 4.0 µm. Semua karakter makro dan mikromorfologi cocok dengan kisaran variasi spesies Ilyonectria crassa (Cabral et al., 2012).
Urutan daerah DNA spesifik spesies (ITS, b-tubulin, TEF 1α) sepenuhnya bertepatan dengan urutan strain I. crassa yang kami pelajari sebelumnya (Chudinova et al., 2019, Tabel 1). Untuk mempelajari prevalensi I. crassa di wilayah lain dan menganalisis spektrum kultur yang terkena dampak, urutan DNA serupa dalam database GenBank dianalisis (Tabel 1). Tumpang tindihnya adalah 86 hingga 100%. Urutan ketiga wilayah DNA dari strain I. crassa "kentang" identik dengan urutan strain yang diisolasi dari umbi lily dan akar narcissus di Belanda dan dari akar ginseng di Kanada. Kami gagal menemukan strain I. crassa lainnya dengan tiga urutan serupa yang dianalisis dalam database terbuka. Namun, analisis sekuens ITS dan b-tubulin yang diendapkan menunjukkan adanya I. crassa pada daun tulip di Inggris. Jamur dengan sekuens ITS yang serupa diidentifikasi dalam analisis mikobiota akar aspen di Kanada dan akar beech di Italia, umbi kentang di Arab Saudi (Tabel 1). Hasil penelitian menunjukkan bahwa I. crassa memiliki penyebaran global dan mampu menginfeksi berbagai jenis tumbuhan.
Saat menentukan patogenisitas irisan tomat dan kentang hari ke-5, diameter lesi mencapai 1.5 cm, strain yang diteliti tidak menginfeksi buah tomat utuh dan umbi kentang utuh. Namun, sepal mempengaruhi tomat. Untuk menyingkirkan kemungkinan kontaminasi dari miselium yang berkembang pada irisan umbi kentang, diisolasi isolat jamur ke dalam kultur murni. Itu benar-benar identik dengan strain orang tua. Ternyata, I. crassa adalah parasit luka.
Perlakuan pra-tanam umbi benih dengan fungisida mengurangi perkembangan penyakit pada tanaman selama musim tanam. Untuk pemilihan fungisida yang efektif, penting untuk menilai fungisida mana yang efektif melawan I. сrassa. Pekerjaan mempelajari zat aktif fungisida yang tersebar luas - fludioxonil, azoxystrobin, difenoconazole. Fludioxonil diformulasikan dalam beberapa campuran yang digunakan untuk pembalut benih dan umbi benih sebelum ditanam. Fludioxonil (Maxim) juga digunakan untuk merawat umbi benih sebelum disimpan. Difenokonazol dan azoxystrobin juga termasuk dalam sejumlah sediaan yang digunakan untuk pengolahan bahan benih, serta sediaan yang ditujukan untuk pengolahan tanaman vegetatif (Katalog Negara ..., 2020).
Laju pertumbuhan I. crassa dipelajari pada media (Gbr. 2) dengan konsentrasi bahan aktif yang berbeda: fludioxonil (EC50 = 0.4 ppm), azoxystrobin (EC50 = 4 ppm), dan difenoconazole (EC50 = 7.4 ppm) (Tabel 2). Sediaan ini dapat dianggap sangat efektif terhadap I. crassa, karena EC50-nya secara signifikan lebih rendah daripada konsentrasi sediaan yang direkomendasikan dalam cairan kerja yang digunakan untuk merawat umbi. Menurut Katalog Negara ... (2020), konsentrasi fludioxonil dalam cairan untuk perawatan umbi kentang adalah dari 500 hingga 1000 ppm, azoxystrobin (dalam cairan untuk merawat bagian bawah alur) - 3750-9375 ppm, difenoconazole (dalam cairan untuk merawat tanaman vegetatif) - 187.5– 625 ppm.
Tabel 1. Kesamaan urutan urutan spesies spesifik dari strain 18KSuPT2 dan strain Ilyonectria crassa tersedia dalam database Genbank
Regangan | Tanaman inang, tempat ekskresi | Nomor urut disimpan di GenBank, persentase kesamaan | Link | ||
NYA | β-tubulin | TEF 1a | |||
17KSPT1 dan 18KSuPT2 | Umbi kentang, wilayah Kostroma | MH818326 | MH822872 | MK281307 | Chudinova et al., 2019, karya ini |
CBS 158/31 | Akar Narcissus, Belanda | JF735276 100 | JF735394 100 | JF735724 99.3 | Cabral dkk., 2012 |
CBS 139/30 | Lily bulb, Belanda | JF735275 100 | JF735393 99.7 | JF735723 99.3 |
|
NSAC-SH-1 | Akar ginseng, Kanada | AY295311 99.4 | JF735395 100 | JF735 / 725 99.6 |
|
RHS235138 | Daun tulip, Inggris | KJ475469 100 | KJ513266 100 | ND | Denton, Denton, 2014 |
MT294410 | Akar Aspen, Kanada | MT294410 100 | ND | ND | Ramsfield dkk., 2020 |
ER1937 | Beech, Italia | KR019363 99.65 | ND | ND | Tizzani, Haegi, Motta. Pengiriman langsung |
KAUF19 | Umbi kentang, Arab Saudi | HE649390 98.3 | ND | ND | Gashgari, Gherbawy, 2013 |
ND = tidak disimpan
Tabel 2. Resistensi Ilyonectria crassa terhadap fungisida
(zat aktif) | EC50, ppm | ||||
Hari 3 | Hari 5 | Hari 7 | |||
Kontrol | 17 2 ± | 33 5 ± | 47 3 ± | ||
Quadris, KS (fsoxystrobin) | 18 1 ± | 34 2 ± | 48 2 ± | ||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
Maxim, KS (fludioxonil) | 16 1 ± | 28 2 ± | 48 2 ± | ||
7 1 ± | 13 3 ± | 19 4 ± | |||
5 1 ± | 12 1 ± | 17 5 ± | |||
Skor, EC (difenoconazole) | 18 1 ± | 35 2 ± | 48 1 ± | ||
11 1 ± | 24 3 ± | 35 4 ± | |||
11 1 ± | 13 1 ± | 17 3 ± |
Dalam penelitian kami, strain I. crassa diisolasi dari umbi kentang di wilayah Kostroma dan Moskow (Chudinova et al., 2019). Proporsi galur jamur yang tinggi dengan urutan ITS yang identik dengan I. crassa terungkap saat menganalisis mikobiota umbi kentang di Arab Saudi (Gashgari dan Gherbawy, 2013). Rupanya, I. crassa tidak selangka kentang seperti yang terlihat. Percobaan kami menunjukkan bahwa jamur dapat menginfeksi buah tomat yang rusak. Diketahui dari literatur bahwa I. crassa mampu berkembang secara saprotrofi di dalam tanah (Moll et al., 2016), serta mempengaruhi berbagai tanaman, bahkan yang jauh secara taksonomis seperti bakung, lili, ginseng, aspen, dan beech (Tabel 1). satu). Ternyata, banyak tumbuhan liar dan taman yang bisa menjadi cagar I. crassa. Hal di atas menunjukkan bahwa saat mengembangkan tindakan perlindungan, perlu mempertimbangkan kemungkinan mempengaruhi umbi kentang dengan jamur ini. Sediaan yang luas untuk pengobatan umbi kentang yang mengandung fludioxonil, azoxystrobin, dan difenoconazole telah menunjukkan khasiat fungisida yang tinggi terhadap I. crassa.
Pekerjaan ini didukung oleh Yayasan Rusia untuk Penelitian Dasar (Hibah No. 20-016-00139).
Artikel ini dipublikasikan di jurnal "Plant Protection Bulletin", 2020, 103 (3)